Выявление и дифференциация возбудителей коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней методом мультиплексной полимеразной цепной реакции

• Автор: Абид Набиль Бен Салем
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика семейства Согопагс1ае.

1.2. Основные свойства коронавирусов

1.2.1. Строение вириона.

1.2.2. Физикохимические свойства.

1.2.3. Структура генома.

1.2.4. Гены и протеины

1.2.5. Репликация.

1.2.6. Антигенные свойства

1.3. Характеристика семейства Веоугсае.
1.4. Основные свойства ротавирусов
1.4.1. Строение вириона.
1.4.2. Физикохимические свойства.
1.4.3.Структура генома
1.4.4. Гены и протеины
1.4.5. Репликация.
1.4.6. Антигенные свойства
1.5. Эпизоотологические данные
1.6. Патогенез и иатологоанатомическис изменении
1.7. Клинические признаки.
1.8. Диагноз и дифференциальный диагноз.
1.9. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Биологические материалы.
2.1.2. Оборудование.
2.1.3. Растворы, ферменты и реактивы.
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Выделение вирусной РНК из патологического материала от свиней
2.2.2. Денатурация дцРНК.
2.2.3. Обратная транскрипция.
2.2.4. Мультиплексная полимеразная цепная реакция
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Разработка метода мПЦР для выявления и дифференциации геномов коронавирусов и ротавируса свиней
3.1.1. Анализ нуклеотидных последовательностей генов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС
3.1.2. Выбор первичной структуры праймеров.
3.1.3. Оптимизация условий постановки мПЦР.
3.2. Применение мПЦР для выявления геномов коронавирусов
и рота вируса свиней.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия ЭМ, иммуноферментный анализ ИФА, реакция нейтрализации , не всегда обладают достаточной чувствительностью. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция ПЦР, главным достоинством которой является специфичность, чувствительность. Кроме этого, мультиплексный вариант ПЦР является быстрым методом для выявления нескольких возбудителей в одной реакции. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вирусов. Однако метод выявления и дифференциации вирусов этой группы не был разработан в Российской Федерации. Перечисленные обстоятельства явились основанием при определении темы диссертационной работы. Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка метода выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС в вируссодержащих образцах с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции. ТГЭС, ЭДС и РВС в материалах от естественно инфицированных или экспериментально зараженных этими вирусами свиней, а также в культуральных вируссодержащих материалах. Научная новизна н теоретическое значение. Разработан метод выявления и дифференциации вирусов коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней в образцах вируссодержащего материала с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции. Впервые определена нуклеотидная последовательность уникального фрагмента генома в полевых изолятах вируса ЭДС, выделенных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры фрагмента гена М данных изолятов вируса ЭДС. Доказано, что выявленные изоляты содержали нуклеотидные замены в трех позициях гена М. Эти замены отсутствуют у других штаммов вируса ЭДС, нуклеотидные последовательности которых депонированы в вепЬапк. Нуклеотидные последовательности фрагмента гена М выявленных нами изолятов вируса ЭДС были депонированы в международной базе данных бепЬапк под номерами доступа Еи , Е1Л1, ЕШ2, ЕШ3, Е, Е, ЕШ6, Е1Л7, ЕШ8, ЕШ9, ЕШ0 и Еи . С использованием разработанного метода определена нуклеотидная последовательность фрагментов геномов нолевых изолятов РВС и ТГЭС, выделенных на территории РФ. Изучены вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами ТГЭС, РВС и ЭДС. Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработана Методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции г. Методика прошла комиссионные испытания, рассмотрена и одобрена ученым советом, утверждена директором ФГУ ВНИИЗЖ. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах VI Всероссийской научнопрактической конференции Генодиагностика инфекционных заболеваний Москва, г. ФГУ ВНИИЗЖ в гг. Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, одна из них опубликована в журнале Ветеринарная патология, который предусмотрен перечнем ВАК РФ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 7 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, собственные исследования материалы и методы, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 6 источников, в том числе на русском языке и 2 зарубежных. Работа иллюстрирована таблицами и 9 рисунками. Коропавирусы оболочечные РНКсодержащие вирусы. Первые выделенные коропавирусы относили к ортомиксо или парамиксовирусам, поскольку они напоминали последних по структуре и размерам частиц. Затем было доказано, что коронавирусы представляют собой отдельную группу вирусов, во многом отличающихся от ортомиксо и парамиксовирусов , . Семейство коронавирусов вместе с семейством артеривирусов входит в состав порядка нидовирусов 9. В состав семейства коронавирусов входят род коронавирусы и род торовирусы 4. Вирусы ТГЭС, ЭДС и РКВС относятся к группе 1.