О пространственной структуре вируса гриппа : Исследование методом тритиевой планиграфии

• Автор: Федорова, Наталия Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 с. : ил.

Введение тритиевой метки в исследуемые

объекты.

5. Контроль за сохранением нативности меченых

препаратов вируса.

5.1 Анализ меченных тритием вирусных белков.

5.2 Анализ включения метки в структурные

компоненты липосом.

6. Ковалентное связывание М1 белка с

тиопропилсефарозой 6В.

7. Расщепление иммобилизованного М1 белка и разделение пептидов.

8. Определение удельного мечения пептидов.

Глава III. Результаты и обсуждение.
1. Оптимизация методов выделения основных
структурных белков вируса гриппа.
2. Модель для изучения молекулярных
механизмов мембранбелковых
взаимодействий.
3. Получение меченных тритием вирионов
вируса гриппа и анализ включения метки в основные структурные белки.
4. О локализации М1 белка в вирионе вируса
гриппа.
5. Определение внутримолекулярного
распределения метки в М1 белке.
6. Моделирование укладки М1 белка в вирусе
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


РНК, а также данные о его структурных и неструктурных белках . Локализация каждого компонента в вирусной частице изучалось многими биофизическими и биохимическими методами. В частности, важный вклад в понимание структуры компонентов и их организацию в вирусной частице внесли методы электронной микроскопии. Работы с их использованием широко представлены в обзоре . Так, в частности, структуры низкого разрешения поверхностных гликобелков НА и , внутренних РНКбелковых комлексов и нуклеобелка , а также некоторые черты матриксного М1 белка все они были изучены различными методами электронной микроскопии. Существенный вклад в общее представление о молекулярной организации поверхности вириона внесли также работы по i i иодированию , дансилированию , химическим сшивкам белков в вирионе ,, по протеолитическим обработкам , исследования с использованием фотореактивируемых и флуоресцентно меченых проб . Как результат интенсивных исследований, уже в начале х годов была общепринята модель организации вириона вируса гриппа, по которой М1 белок располагался в слое под липидным бислоем . Рис. Схематическое представление структурной организации вириона вируса гриппа из обзора Т. Стэгман и Р. Хелениус . Показаны небольшая часть вириона изнутри нижняя часть рисунка и снаружи верхняя часть рисунка. Однако, ряд экспериментов по связыванию с вирионами вируса гриппа моноклональных антител к М1 белку, свидетельствовали о специфическом экспонировании ряда участков М1 белка на поверхности вириона подобно данным, полученным в работе . И эти результаты, вплоть до последних работ по криоэлектронной микроскопии вируса гриппа А, поддерживали иную модель вириона, по которой М1 белок рассматривался как трансмембранный с частичной экспонированностью на внешнюю сторону липидного бислоя . , кристаллической структуры НА в комплексе с высокоаффинными аналогами рецептора , кристаллической структуры мембрандистального фрагмента субъединицы НА в его мембрансливающем активном состоянии , кристаллической структуры 1 фрагмента РНК связывающего домена неструктурного белка 1 и, наконец, кристаллической структуры фрагмента матриксного М 1 белка . Возникновение и развитие нового метода, криоэлектронной микроскопии, дало мощный толчок в изучении архитектуры интактных биологических образцов. Быстрое замораживание в форме стекла тонкой пленки вирусной суспензии и использование специального устройства для переноса и поддержания образца в ходе исследования при температуре жидкого азота а в более поздних модификациях при температуре жидкого гелия во избежание расстекловывания изменения фазового состояния образца дало возможность изучать нативные негидратированные вирусные частицы. Первые криомикроскопические изображения вируса гриппа А были получены в г . В работе была представлена фотография неочищенного препарата вируса гриппа А штамм Х, где хорошо были видны мембраны больших вирусных частиц, представляющие липидные бислои. К сожалению, тогда авторы не заметили на своих снимках еще один тип вирусных частиц, малых вирусных частиц с небислойными оболочками, что было обнаружено в более поздних работах другими исследователями . А, Фьюуоши и др. Оболочки наиболее больших вирусных частиц были фосфолипидными бислоями. При этом, хроматографическая фракция, содержащая зти частицы была в значительной степени лишена вирусной активности. Оболочки большинства вытянутых и малых сферических вирусных частиц были принципиально иными. Они представляли собой комбинацию тонкого внешнего липидного монослоя толщиной 3. Эти последние частицы содержали основную часть вирусной активности в препаратах. Полученные данные в сочетании с компьютерным моделированием позволили авторам предложить структурную модель мембраны интактных биологически активных частиц . Структура М 1 белка. Его основные функциональные и антигенные характеристики. Матриксный М1 вируса гриппа многофункциональный белок, вовлеченный в различные стадии жизненного цикла вируса ,.