Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота

• Автор: Яковлева, Анастасия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ1.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структурная организация капсида ВЯ .

2.2. Структурнофункциональная организация генома ВЯ

2.3. Патогенезящура.

2.4. Вакцинопрофилактика.

2.5. Серодиагностика ящура.

2.5.1. Выявление и типирование вируса.

2.5.2. Дифференциация постинфекционных и поствакцинапьных антител.

2.6. Заключение по обзору литерату ры

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы
3.2. Методы.
3.2.1. Выделение вирусной РНК из вируссодержащего материала
3.2.2. Расчет и синтез праймеров.
3.2.3. ОТПЦР
3.2.4. Молекулярное клонирование продуктов ПЦР.
3.2.5. Нуклеотидное секвенирование.
3.2.6. Экспрессия рекомбинантных белков
3.2.7. Очистка рекомбинантных белков.
3.2.8. Электрофорез белков в ПААГе.
3.2.9. Непрямой вариант ИФА
3.2 Статистическая обработка результатов.
3.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.31 Конструирование плазмид, экспрессирующих рекомбинантные неструктурные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура.
3.3.2. Оптимизация условий экспрессии рекомбинантных белков ЗА,
ЗВиЗЛВ
3.3.3. Очистка рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ
3.3.4. Исследование антигенной активности и специфичности рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ
3.3.5. Исследование стабильности рекомбинантных белков ВЯ при хранении
3.3.6. Разработка непрямого варианта ИФА.
3.3.7. Сравнение ИФА на основе ЗА, ЗВ и ЗАВантигенов
3.3.8. Разработка набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным
методом.
3.3.9. Разработка непрямого варианта ИФА для определения антител
к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сывороток крови КРС.
3.3 Разработка набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сыворотки крови КРС в
непрямом варианте ИФА.
3.3 Использование наборов в серологических исследованиях
4.0БСУЖДЕНИЕ
5.ВЫВОД Ы.
6.ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ.
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Е.соП или в бакуловирусной системе. Однако отечественных тестсистем до сих пор создано не было. Цели и задачи исследования. Основная цель нашей работы заключалась в получении рекомбинантных антигенов и разработке на их основе иммуноферментной тестсистемы, позволяющей выявлять антитела к неструктурным белкам вируса ящура. Научная новизна исследования. КРС. Показано, что ИФА на основе белка ЗА превосходит по диагностической чувствительности и специфичности ИФА на основе белков ЗВиЗАВ. На основе ЗАИФА разработаны два отечественных диагностических набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом, позволяющие дифференцировать вакцинированный против ящура и инфицированный вирусом ящура КРС. Практическая значимость исследований. Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении, одобренная ученым советом и утвержденная директором Центра . Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении, одобренный ученым советом и утвержденный директором Центра . Публикации научных работ. По теме диссертации опубликовано три научных работы. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной конференции Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных в году, на заседаниях ученого совета в гг. Основные положения, выносимые на защиту. Рекомбинантные антигены ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура. Иммуноферментные тестсистемы на основе рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС и результаты их сравнительных испытаний. Диагностический набор для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура методом последовательного разведения сывороток крови КРС. Диагностический набор для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура методом одного разведения сывороток крови КРС. Результаты серомониторинга ящура с использованием разработанных диагностических наборов за гг. Структура и объем работы. Диссертация изложена 0 на страницах, иллюстрирована рисунками и таблицами. Список используемой литературы включает 2 источника, из которых 1 иностранный. Исследования по диссертационной работе выполнены в гг. Федеральном центре охраны здоровья животных ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю к. .. Щербакову и сотрудникам института д. В.Л. Узюмову, к. .. Каныииной, С. Р. Кременчугской, к. Н.С. Мудрак, вед. Н.В. Вавиловой, вед. Фоминой С. Н. за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации. УР1 Ю, УР21В, УРЗ1С и УР41А. УР2 и УР4 и основным структурным компонентом пустых капсидов. УР1, УР2 и УРЗ расположены на поверхности капсида, тогда как УР4, модифицированный на Ыкоице остатком миристиновой кислоты, является внутренним белком. Белки УР13 имеют сходные размеры 87 а. Протеины УР13 состоят из 8 антипараллельных рцепей. Соединяющие эти цепи короткие участки неупорядоченной структуры, или соединительные петли, так же, как и Сконцы трех протеинов экспонированы на поверхности капсида , , 1. В отличие от других пикорнавирусов, у которых на поверхности капсида имеются углубления, или каньоны, вовлеченные во взаимодействие с клеточными рецепторами, капсид ВЯ сравнительно гладкий, без видимых каньонов или впадин, за исключением вН петли белка УР1, которая является наиболее выступающей частью поверхности вириона , 2. В отличие от других пикорнавирусов, капсиды ВЯ характеризуются наличием гидрофобной поры на оси симметрии пятого порядка, которая обеспечивает проникновение молекул интеркалирующих красителей и ионов цезия. Эта особенность объясняет инактивацию инфекциоиности вируса фотореактивными красителями и самую высокую среди пикорнавирусов плавучую плотность вирионов ВЯ 1,1, гсм3. ВЯ является его нестабильность в кислой среде.