Болезнь Ауески, иммунологическая характеристика гликопротеинов gE и gB вируса и разработка методов серологической диагностики болезни и контроля "маркированных" вакцин

• Автор: Моренков, Олег Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 283 с. : ил.

4.1.4.2. Локализация линейных эпитопов с помощью рекомбинантного фрагмента, экспрессированного в Е.соИ
4.1.4.3. Экспрессия рекомбинантного Иконцевого фрагмента в эукариотической системе и картирование эпитопов

4.2. Изучение антигенной структуры гликопротеина В

4.2.1. Топографическое эпитопное картирование В

4.2.2. Характеристика эпитопов

4.2.3. Определение локализации эпитопов в границах аминокислотной последо ности

4.2.3.1. Получение и характеристика рекомбинантных фрагментов гликопротеина

4.2.3.2. Картирование линейных эпитопов и областей, вовлеченных в формирование конформационных эпитопов, с помощью рекомбинантных белков
4.2.3.3. Картирование линейных эпитопов с помощью фрагментов В, полученных с помощью протеолиза и бромциана

4.3. Консервативность антигенных структур гликопротеинов и В ВБ А

ГЛАВА 5. ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ НА ГЛИКОНРОТЕИНЫ яЕ и ВБЛ

5.1. Вклад конформационных и линейных эпитопов гликопротеинов Е
и В в индукцию гуморального иммунного ответа
5.2. Исследование гуморального иммунного ответа на отдельные
области гликопротеинов В и Е с помощью рекомбинантных фрагментов
5.3. Эпитопспенифический гуморальный иммунный ответ на д,Е и
ГЛАВА 6. ИНДУКЦИЯ ЗАЩИТНОГО ИММУНИТЕТА
ГЛИКОПРОТЕИНОМ яВ ВБЛ
6.1. Вируснейтралнзующая активность Вспецифических мкАТ
6.2. Влияние пцифичкиx мкАТ на проникновение вируса в клетки
6.3. Влияние Вспецифических мкАТ на распространение вирусной
инфекции от клетки к клетке
6.4. Пассивная иммунизация мышей пцифичкими мкАТ
6.5. Защитная активная иммунизация мышей рекомбинантными фрагментами глнкопротеина
ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ
7.1. Разработка тт для дифференциации вакцинированных и инфицированных животных
7.1.1. Блокирующие ИФ
7.1.2. Непрямые дискриминирующие ЕИФА
7.1.2.1. Получение очищенного глнкопротеина
7.1.2.2. Получение и очистка рекомбинантного фрагмента Е
7.1.2.3. Оптимизация непрямых ИФ и сравнительная оценка
непрямых ИФА и бпИФ
7.2. Разработка диагностическго теста для выявления инфицированных
животных среди невакцинированного поголовья
7.2.1. Блокирующие ИФА
7.2.2. Непрямой ИФ на основе аффинноочищенного В
7.2.3. Сравнительная оценка ттв
7.2.4. Сравнительная оценка ИФ и ИФ в выявлении ВБАспецифических антител.
ГЛАВА 8. РАЗРАБОТКА И ТЕСТСИСТЕМ
8.1. Методы технологического контроля и стандартизации изготовления
и тестсистем
8.2. Разработка технологии изготовления компонентов тестсистем, их оптимизация и стандартизация
8.2.1. Выбор производственного вирусного штамма и клеточной системы для наработки вирусного антигена
8.2.2. Получение и очистка вирусных антигенов
8.2.2.1. Очистка вирионов ВБА
8.2.2.2. Очистка гликопротеинов и
8.2.3. Сравнительная оценка антигенов
8.2.4. Приготовление моноклональных и специфических конъюгатов 7 8.2.5 Подготовка положительных и отрицательных контрольных сывороток
8.2.6. Выбор хромогена
8.2.7. Подготовка буферных растворов
8.3. Оптимизация и тестсистем, комплектация и проведение анализов
8.3.1. Определение оптимального соотношения количества сорбированных антигенов и концентрации конъюгатов
8.3.2. Определение пороговых значений ингибирования в и тестсистемах
8.3.3. Схема изготовления и комплектация тестсистем
8.3.4. Проведение анализа и контроль тестсистем
8.4. Определение параметров разработанных и гесгсистем и сравнительная оценка с аналогичными тестами
8.5. Опыт совместного применения дискриминирующей тестсистемы и инакти ванной маркированной вакцины для оздоровления хозяйств
ГЛАВА 9. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОГРОЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТСИСТЕМ И ИНАКТИВИРОВАННЫХ МАРКИРОВАННЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ БА
9.1. Метод контроля маркированности производственного вирусного штамма
9.2. Метод контроля маркированности вирусного сырья
9.3. Метод контроля маркированности вакцины
9.4. Метод контроля содержания вирусного антигена в ВСЖ
9.5. Метод контроля антигенности инактивированных маркированных вакцин
9.6. Методы контроля содержания и антигенов в вирусном сырье при изготовлении тсстсистем
ГЛАВА . ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
.1. Получение панелей и специфических мкАТ
.2. Антигенная структура гликопротеннов и
.3. Гуморальный иммунный ответ на гликопротеины и
.4. Индукция защитного иммунитета гликопротеином
.5. Разработка диагностических и тестов
.6. Разработка технологии изготовления и тестсистем
.7. Разработка методов контроля изготовления инактивированных негативных маркированных вакцин
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Повидимому, конкуренция ВБА и ВПГ1 при совместном инфицировании связана с конкуренцией вирусов за связывание с ограниченным количеством О рецепторов на плазматической мембране 8. Экспрессия ВПГ1 в клетках ограничивает развитие вируса клетки, экспрессирующие экзогенный ВПГ1, становились резистентными к инфицированию ВПГ1 . Предполагается, что йО, находящийся в составе клеточной мембраны, взаимодействует с какимто клеточным рецептором, выключая последний из взаимодействия с вирионным Однако, подобного феномена не обнаружено для ВБА клетки, экспрессирующие экзогенный ВБА оставались чувствительными к инфицированию ВБА 1. В отличие от йЭ ВПГ1, гликопротеин ВБА играет важную роль в проникновении вируса в клетки, но не в прямом распространении вируса от клетки к клетке 3, 8, 0. Антитела к эффективно нейтрализуют вирус после его адсорбции 0, 2, фенотипически комплементированный по гликопротеину зОнегативный мутант ВБА распространяется по культуре клеток только через непосредственно контактирующие клетки, а освободившиеся в культуральную среду внрионы неинфекционны. В мутантных нгтiвныx вирусных штаммах, адаптированных к размножению в некомплемеитирующих культурах, процесс проникновения вирусов был значительно замедлен. ВБА. При этом зОнегативные мутанты эффективно транссинаптичсски распространяются в ЦНС 9, 4. Гликопротеины Н и обнаружены у герпесвирусов всех трх подсемейств герпесвирусов 3, 6. По уровню консервативности среди герпесвирусных белков гликопротеины уступают только гликопротеинам , 9, 6, 7, 0, 3, 6. Гены и расположены в 1части генома ВБА. Гликопротсины йН и формируют функциональный комплекс, который удерживается нековалентными взаимодействиями. В отсутствие гликопротеин Н не приобретает правильной конформации и не включается в оболочку вируса. Гликопротеин , обеспечивает заякоривание комплекса в липидном бислое. Гликоротеины Н и являются жизненно необходимыми для развития вируса комплекс принимает участие в проникновении вируса в клетку и распространении инфекции от клетки к клетке 9. Антитела к этому комплексу блокируют стадию проникновения вируса в клетки 7. У ЦМВЧ и ВЭБ с I. Гликопртеины и ВБА не являются жизненнонеобходимыми для развития вируса вирионы, у которых отсутствуют и в оболочке, жизнеспособны, но отличаются замедленным проникновением внутрь клеток . В отличие от комплексов и , может включаться в оболочку вируса без глнко протеи на . Гликопротеин ВБА не включается в оболочку вирионов и секретируется из инфицированных клеток в больших количествах 3. Гликопротеин не является жизненнонеобходимым для развития вируса i vi 9. Делегирование гена не снижает вирулентности вируса 9. Функция ВБА до сих пор не определена. Предполагается, что необходим для развития вируса i viv, так как к настоящему времени не выявлено ни одного естественного мутанта ВБА, у которого отсутствовал бы
1. В развитие противовирусного иммунитета при БА вовлечены ряд механизмов. При этом, повидимому, не существует универсального механизма защиты от заболевания на каждом этапе инфекции относительный вклад того или иного защитного механизма в защиту животного от инфекции изменяется. Особенностью противовирусного иммунитета при болезни Ауески является его относительная защита, что вообще характерно для герпесных инфекций. При первичной инфекции, неспецифические факторы защиты являются первой линией борьбы организма в то время, когда специфические механизмы еще не активировались. При вторичном инфицировании, специфические механизмы защиты быстро активируются и играют основную роль в борьбе против заболевания. Среди неспецифических факторов, повидимому, важнейшую роль играют натуральные киллеры и интерфероны. Натуральные киллеры отличаются от цитотоксических лимфоцитов и обладают выраженной цитотоксичностыо против ВБАинфицированных клеток. У свиней существуют по крайней мерс 2 популяции натуральных киллеров . Действие клеток натуральных киллеров усиливается интерферонами. Кроме этого, ашггерферон обладает выраженной активностью против ВБА в культуре клеток. После инфицирования интерферон появляется в сыворотке через ч и достигает максимальной концентрации на день .