Взаимодействие транспортного белка 1 и белка оболочки при трансляционной активации потексвирусов

• Автор: Смирнов, Александр Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

Оглавление
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура вирусной частицы и ее конформ анионные перестройки

1.1. Структура БО, входящего в состав вириона ХВК

1.2. Гликозилирование БО ХВК

1.3. активация трансляции инкапсидированной РНК.

1.3. Активация трансляции инкапсидированной РНК при фосфорипироваиии КО ХВК II

1.3.2 Активация ТБ1 трансляции инкапсидированной РНК

1.4. Разборка вирусной частицы ХВК

1.5. Структура транспортной формы ХВК.
2. Функции транспортного белка 1
2.1. Свойства ТБ 1 ты vi.
2.1.1 РНКсвязывающая активность ТБ1
2.1.2 Хсликазная активность ТБ1.
2.1.3. Взаимодействие ТБ1 с вирусной частицей.
2.2. ФУНКЦИИ ТБ 1 I VIV.
2.2.1. Роль ТЫ в обеспечении межклеточного транспорта вируса
2.2.2. ТБ1 ингибитор умолкания генов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ШМ1НММ1МНМНММНИ1ММНННМНМНМ1ММ1МИ1МН1МНММ1ННМММ
1. Получение РНП комплексов.
2. Анализ вРНП методом торможения в геле
3. Гидролиз рекомбинан тных белков протеазой фактором Ха
4. Полимеразная цепная реакция ПЦР
5. Рестрикция.
6. Лигирование ДНК
7. Выделение плазмидной ДНК.
8. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД
8.1. Получение конструкций, содержащих гены мутантов ТБ1
8.2. Получение конструкций, содержащих гены БО и его делец ионных мутантов
9. Трансформация клеток Е. сои штамма М.
. Экспрессия рекомбинантных белков
. Хроматографическая очистка Гис6рекомбинантных белков ил i2ИИТРИЛОТРИЛЦБТАТНОЙ АГАРОЗЕ.
. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле
. выделение препарата Хвируса КАРТОФЕЛЯ
. выделение белка оболочки ХВК
. ВЫДЕЛЕНИЕ РНК ИЗ ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ
. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ I VI.
. ТРАНСЛЯЦИЯ I VII ЭКСТРАКТЕ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ.
. ИММУНОЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ.
. Электронная микроскопия.
. ФАРВВСТЕРНБЛОТ
. ЙМУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Локализация участка БО, вовлеченного в связывание ТБ1 с вРНП.
1. Получение рекомбинантных БО и его Сконцевых делеционных мутантов
2. Получение рекомбинантного БО, лишенного шести гистидинового пептида
3. Изучение способности рБО и его Сконцевых делеционных мутантов образовывать вРНП
4. Поиск области БО, обеспечивающей связывание ТБ с вРНП.
II. Локализация участка ТБ 1, ответственного за взаимодействие с вирусной частицей и активацию трансляции инкапсидированной РНК
. Локализация участка ТЫ, ответственного за взаимодействие с вирусной частицей
2. Локализация участка ТЫ, ответственного за активацию трансляции инкапсидированной РНК
3. Влияние фосфоричирования на способность ТБ активировать трансляцию инкапсидированной РНК
Заключение.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


РНК, белком оболочки БО и первым транспортным белком ТБ1 . В нашей лаборатории показано, что при инкубации РНК ХВК с БО, в присутствии и в отсутствии ТБ1, i vi образуется вирусный рибонуклеопротеид вРНП, названный однохвостой частицей i i i и представляющий собой неполностью собранный вирион v . РНК ХВК, находящаяся в составе вирусной частицы или вРНП, недоступна для трансляции i vi. Связывание ТБ1 ХВК с вирусной частицей или вРНП активирует трансляцию инкапсидированной РНК v . v . Мы предполагаем, что РНК ХВК транспортируется в соседнюю клетку в составе комплексов ТБ1 с вРНП или вирионом ХВК. Настоящая работа посвящена локализации участков молекул БО и ТБ1, участвующих во взаимодействии ТБ1 с вРНП и вирусной частицей ХВК, приводящему к активации трансляции инкапсидированной РНК. Хвирус картофеля ХВК типовой представитель рода относящегося к семейству Геномная РНК ХВК длинной нуклеотидов, содержащая кэп структуру на 5 конце и поли А последовательность на 3 конце, кодирует пять белков. Репликаза 5 К транслируется непосредственно с геномной РНК, а три транспортных белка ТБ1, ТБ2, ТБЗ продукты тройного блока генов и белок оболочки БО с субгсномых РНК. Гибкий нитчатый вирион ХВК включает в себя около субъединиц БО, образующих спиральную структуру, между витками, которой заключена вирусная РНК. На каждый виток спирали приходится около 8,9 субъединиц БО. Длина вирусной частицы ХВК составляет около 0 им при диаметре около нм. Поверхность вирусной частицы изрезана бороздами, часть из которых параллельна вертикальной оси вириона, а другие повторяют его спиральную структуру Рагкег е а. Ни вирионы ХВК, ни свободные субъединицы БО не образуют кристаллов, которые можно было бы изучать методом дифракции рентгеновских лучей. Таким образом, методы, позволяющие детально описать структуру БО, находящегося в составе вирусной частицы, не применимы к ХВК. В работе v , а авторы исследовали вирион ХВК методом тритисвой планиграфии. Частицы ХВК бомбардировали потоком высоко энергетических атомов трития, которые, замещая атомы водорода, включались в белковую цепь. Наиболее активно атомы трития включаются в аминокислоты, располагающиеся на поверхности вирусной частицы. Таким образом, изучив распределение тритиевой метки в полипептидной цепи, авторы определили, какие аминокислотные остатки БО располагаются на поверхности вирусной частицы. Исследование частицы ХВК методом тритиевой планиграфии показало, что концевоЙ участок около аминокислотных остатков БО экспонирован на поверхность вириона. Авторы также исследовали вирионы, образованные вирусной РНК и БО ХВК, у которого делегированы или концевых аминокислотных остатков. Оказалось, что в таких вирусных частицах тритиевая метка включается как в концевую, так и в Сконцевую часть полипептидной цепи БО. То есть удаление концевых ти или аминокислотного остатка БО, меняет его структуру, таким образом, что Сконцевая часть БО становится доступной для активированных тритиевых атомов. Анализируя возможные конформации полипептидной цени БО ХВК, а также принимая во внимание данные тритиевой планиграфии, авторы предложили модель третичной структуры БО, входящего в состав вириона ХВК Рис. Согласно этой модели, полипентидная цепь БО ХВК образует один домен, аминокислотных остатков которого входят в состав аспиралей, а около рстрендов, которые образуют два слоя v . БО, находится на поверхности вирусной частицы. Предложенная модель согласовывалась как с данными тритиевой планиграфии, так и с результатами исследования поверхности вирусной частицы с помощью специфичных моноклональных антител i , . v . v . концевой участок ВО находится на поверхности вирусной частицы. Рис. Модель структуры входящего в состав вирусной частицы БО ХВК. Стрелкой указан сайт разрезания трипсином. Предложена в работе v , .