Разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома

• Автор: Щелкунов, Игорь Степанович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 110 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Аквакультура состояние и перспективы развития

2.2. Общая характеристика возбудителя болезни.

Ф 2.2.1. Гсография распространения болезни.

2.2.2. Эпизоотическая обстановка по болезни в России.

2.2.3. Клинические признаки и патологоанатомические изменения

2.2.4. Строение вириона .

2.2.5 Антигенные свойства вируса.

2.3. Диагностика болезни

2.3.1. Идентификация возбудителя серологическими методами

2.3.2. Идентификация рабдовирусов рыб на основе анализа генома
2.4. Филогенетический анализ генома рабдовирусов рыб.
2.5. Заключение по обзору литературы
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Штаммы
3.1.2. Ферменты
3.1.3. Реактивы
3.1.4.Сред ы.
3.1.5. Лабораторное оборудование.
3.2. Методы.
3.2.1. Культивирование вирусов.
3.2.2. Получение патматсриала от рыб.
3.2.3. Концентрирование вируса ВВК.
3.2.4. Фенольнодетергентный метод выделения РЖ
3.2.5. Выделение РНК с помощью гуанидин изотиоцианата натрия
3.2.6. Синтез кДНК и клонирование.
3.2.7. Трансформация клеток Е i с применением СаСЬ.
3.2.8. Постановка дотгибридизации
3.2.9. Постановка ОТПЦР
3.2 Анализ ПЦР продуктов
3.2 Рестрикционный анализ продуктов ПЦР.
3.2 Компьютерный анализ и сравнение первичных
последовательностей нуклеиновых кислот, расчет олигонуклеотидов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Клонирование фрагментов генома вируса ВВК
. Разработка тестсистемы на основе молекулярной гибридизации
4.3. Разработка тестсистемы для идентификации вируса ВВК с помощью полимеразной цепной реакции.
4.3.1. Оптимизация постановки ПЦР.
4.3.2. Определение специфичности метода ПЦР.
4.3.3. Сравнительная эффективность выявления вируса ВВК в
материалах от рыб методом ПЦР
4.4. Дифференциация штаммов и изолятов вируса ВВК на основе анализа генома
4.4.1. Дифференциация штаммов и изолятов вируса ВВК методом рестрикционного анализа продуктов ПЦР
4.4.2. Дифференциация штаммов и изолятов вируса ВВК при помощи
Ф штаммоспецифической ПЦР.
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ .
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
9. ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а. к. аминокислота
БСА бычий сывороточный альбумин ВВК V весенняя виремия карпа ВГС вирус геморрагической септицемии ДНКаза дезоксирибонуклеаза ДСН до деци л сульфат натрия
дНТФ дезо кс и нуклеотид трифосфаты ИПТГ изопропилбетаДтиогалактопиранозид ИФА иммуноферментный анализ кДа килодальтон кДК комплементарная ДНК МонАТ моноклональные антитела МФА метод флуоресцирующих антител ОТПЦР обратно транскриптазная ПЦР ОРТ открытая рамка трансляции пкг пикограмм пикоМ пикомоль п.о. пар оснований ПЦР полимеразная цепная реакция РНКаза рибонуклеаза СТЕ ТрисЭДТАнатрисвый буфер т.п.о. тысяч пар оснований тРНК транспортная РНК ТЕ трисЭДТА буфер ФСБ фосфатносолевой буфер ЭДТА этилендиаминотетроацетат
ВВЕДЕНИЕ


При совместном выращивании в поликультуре с карпом возбудитель заболевания выделяли также от белого амура, белого и пестрого толстолобиков, золотого карася, европейского сома и щуки. Болезнь широко распространена в европейских странах с развитым карповодством, с г. США , а в г. Китае 1 . В последние годы наблюдается тенденция к глобализации ВВК. Основным путем распространения болезни являются межхозяйственные перевозки живой рыбы, в т. В бывшем СССР возбудитель ВВК был впервые выделен от больных рыб Н. И. Рудиковым . Позднее было установлено, что ВВК широко распространена в рыбоводных хозяйствах центральной и южной зон Европейской части страны в т. Молдове, Беларуси, Литве и Грузии, где она вызывала гибель до карпа основного объекта выращивания в отечественной аквакультуре . В и г. ВВК отмечали в рыбоводных хозяйствах Свердловской и Тверской областей, а с г. Московской области . В современных условиях существует реальная опасность дальнейшего распространения ВВК по стране, что создает угрозу больших материальноэкономических потерь в будущем, когда отечественное рыбоводство вновь заработает в полную силу. В настоящее время диагноз на ВВК в России ставят на основании выполнения комплекса классических требований, включающих анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патологоанатомических изменений, подкрепленный результатами вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы. Хотя диагностика ВВК за последние годы была значительно усовершенствована, сегодня она остро нуждается в новых более быстрых, чувствительных и специфичных методах индикации и идентификации возбудителя. Чехии, Германии и Бельгии, однако эти наборы недостаточно специфичны. Среди них такие как необходимость использования культур клеток рыб, радиоактивных изотопов и другие. Выполненные в последние годы научные разработки отечественных и зарубежных авторов показали, что использование для диагностики ВВК избирательной амплификация участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции ГИДР, дополняя серологические методы, значительно расширяет возможности обнаружения вируса непосредственно в клинических образцах. Одним из перспективных направлений является применение метода ГИДР с последующим рестрикционным анализом и секвенированисм продуктов ГИДР. Сопоставление первичных структур аналогичных участков генома различных изолятов позволяет провести дифференциацию штаммов и изолятов вируса ВВК. Преимуществом этих методов является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота и безопасность. Поэтому изучение генома возбудителя с целью совершенствования имеющихся и разработки новых более эффективных средств диагностики и профилактики данного заболевания является актуальной научной проблемой. Цель н задачи исследования. Целыо данной работы является разработка тестсистем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома. ВВК на основе анализа первичной последовательности гена нуклеопротеина и рестрикционного анализа ПЦРпродуктов. Практическая значимость. Ученым советом и утверждены заместителем генерального директора ФГУП ВНИИПРХ. Разработанные методы и наборы препаратов рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни. Предложен способ дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК с помощью рестрикционного анализа ПЦРпродукта и штаммоспецифической ПЦР. ВВК с помощью ПЦР и рестрикционного анализа. Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГУП ВНИИПРХ и совместных заседаниях Научноконсультативного совета Межведомственной ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН г. Научнопрактической конференции Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре ноября г. Москва, Всероссийской научнопрактической конференции Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб июля г. Борок Ярославской обл.