Биохимические свойства транспортных белков потекс- и гордеивирусов, кодируемых первым из трех генов транспортного модуля

• Автор: Самуилова, Ольга Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:
Структура плазмодесм
Общая характеристика межклеточного транспорта вируса в растении
Системы межклеточного транспорта вирусов в растении:
Вирус табачной мозаики
Вирус мозаики костра
Вирус огуречной мозаики
Межклеточный транспорт вирусов с образованием
тубулярных структур
Межклеточный транспорт вирусов с тройным блоком генов
X вирус картофеля и родственные потексвирусы
Вирус штриховатой мозаики ячменя
Вирус некротического пожелтения жилок свеклы
Вирусные РНК хеликазы
Три суперсемейства предполагаемых РНК хеликаз
Консервативные мотивы
Характеристика вирусных хеликаз
РНК хеликазаня активность РНК и ДНК вирусов
Участие хеликаз, в процессах не связанных с репликацией вирусов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Реактивы
2. Ферменты
3. Векторы для клонирования и бактериальные штаммы
4. Выделение плазмидной ДНК
5. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК
6. Расщепление ДНК рестриктазами

7. Электрофорез в агарозном геле
8. Извлечение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы
9. Затупление концов фрагментов ДНК и лигирование
10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
11. Очистка ПЦР-фрагментов электрофорезом в агарозном геле
12. Амплификация на РНК-матрице
13. Транскрипция in vitro
14. Экспрессия гена 25 кДа транспортного белка ХВК
15. Хроматографическая очистка (Гис)6-транспортных белков
на М2+-нитрилотриацетатной агарозе
16. Электрофорез белков в денатурирующих условиях
17. Перенос белков с полиакриламидных гелей на
нитроцеллюлозные мембраны
18. Субклеточное фракционирование растительного материала
19. Получение антисыворотки к 25 кДа
транспортному белку и иммуноблоттинг
20. Анализ активностей АТФазы, ГТФазы, УТФазы
21. Фотохимическое связывание белков с нуклеозидтрифосфатами
22. Анализ РНК-связывающей активности
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клонирование и экспрессия гена 25 кДа транспортного
белка ХВК и его делеционных вариантов в векторе pQE-ЗО
Аффинная хроматография 25 кДа белка ХВК и его
делеционных вариантов на Ni-HTA агарозе
Анализ НТФазной активности 25 кДа белка ХВК
Анализ НТФазной активности мутантных вариантов
25 кДа белка ХВК
РНК-связывающие свойства 25 кДа белка и его
делеционных мутантов

Экспрессия и очистка 63 кДа белка ПЛВМ и его мутантов
Анализ НТФазной активности 63 кДа белка и его мутантов
Анализ РНК-связывающих свойств 63 кДа белка ПЛВМ и его
мутантных вариантов
Субклеточная локализация 25 кДа белка ХВК в
зараженных растениях
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

по механизму внутренней инициации трансляции, показанная Hefferon et al., 1997.
Известно, что для межклеточного транспорта потексвирусов необходим БО, мутации, ведущие к нарушению сборки вирионов ХВК, предотвращают накопление вируса в инокулированном листе (Beck et al., 1991; Chapman et al., 1992).
До сих пор полностью непонятно какую роль в межклеточном транспорте вируса играет каждый белок тройного блока. Особенно мало известно о функциях 12 кДа и 8 кДа белков. Сравнительный анализ обнаружил, что имеется сходство в аминокислотной последовательности между 12 кДа белком ХВК и соответствующими белками гордеи-, фуро- и карлавирусов. На N- и С-концах этих белков выявлены два блока гидрофобных аминокислотных остатков, между которыми располагается гидрофильный район (Morozov et al., 1987). Для 8 кДа белка ХВК не было показано гомологии с соответствующими белками гордеи- и фуровирусов (Morozov et al., 1989). В N-концевой части этого белка был найден гидрофобный район, за которым следует высоко консервативная среди потексвирусов последовательность, ограниченная с двух сторон остатками цистеина. Интересно, что предсказанная для N-концевой части 8 кДа белка вторичная структура имеет некоторые общие черты с N-концевыми участками клеточных секретируемых белков, имеющих отщепляемый или неотщепляемый сигнальный пептид. В последнем случае этот белок должен быть связан с мембранными структурами. Анализ последовательностей 8 кДа и 12 кДа белков ХВК указал на их вероятную ассоциацию с клеточными мембранами. Это было экспериментально подтверждено в опытах по экспрессии 12 кДа и 8 кДа белков in vitro - продукты находились в мембранной фракции (Morozov et al., 1990). Место локализации 8 кДа белка ХВК на тонких срезах растений табака, инфицированных ХВК, и трансгенных по 8 кДа белку растений картофеля, продукта ОРТЗ, было