Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита

• Автор: Неверов, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 154 с. : ил.

1.1. Семейство xvii. Генетические и биологические свойства.

Классификация. Общие сведения.

1.2. Профилактика заболеваний, вызываемых представителями семейства

xvii.

1.2.1. Вакцины против эпидемического паротита

1.2.2. Вакцины против кори.

1.3. Диагностика заболеваний, вызываемых вирусами семейства xvii

1.3.1. Диагностика эпидемического паротита. Генодиагностика эпидемического паротита.

1.3.2. Диагностика кори

1.3.2.1. Методы лабораторной диагностики кори.

1.3.2.2. Молекулярная эпидемиология и генодиагностика вируса кори.

1.3.2.3. Методы быстрого определения генотипов циркулирующих изолятов вируса кори.
Олигонуклеотидные микрочипы как альтернативный метод генетического анализа циркулирующих штаммов вируса кори.
1.4. Лечение заболеваний, вызываемых вирусами кори и паротита
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.2. Методы
2.2.1. Выделение суммарной РНК.
2.2.2. Проведение реакции обратной транскрипции
2.2.3. Проведение ПЦР
2.2.3.1. Амплификация фрагментов генома вируса паротита.
2.2.3.2. Диагностическая ОТПЦР для обнаружения вируса кори.
2.2.3.3. Амплификация кДНК вируса кори из клинических образцов для проведения анализа
ДНКмикрочипом
2.2.4. Очистка продуктов амплификации после проведения ПЦР.
2.2.5. Клонирование продуктов ПЦР в плазмидный вектор 5 . i
2.2.6. Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК
2.2.7. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.8. Подготовка молекул одноцепочечной РНК для гибридизации на ДНКмикрочипе.
2.2.9. Приготовление ДНКмикрочипов для генотипирования вируса кори
2.2 Гибридизация молекул одноцепочечной РНК на ДНКмикрочипе
2.2 Сканирование ДНКмикрочипов и анализ данных.
2.2 Статистический анализ данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для амплификации и определения
полноразмерных последовательностей генома вируса паротита.
3.2. Генетический анализ изолятов вируса паротита, выделенных на территории г.
Новосибирска
3.3. Изучение генетических свойств вакцинного штамма Ленинград3 вируса паротита.
3.3.1. Определение полноразмерной последовательности генома штамма Л3 вируса
паротита
3.3.2. Исследование состава вирусной популяции в препарате производственного штамма
ф Ленинград3, применяемого при производстве паротитной вакцины.
3.3.3. Исследования генетической стабильности живой паротитной вакцины на основе штамма ЛЗ
3.3.4. Сравнительный анализ последовательности генома вакцинного штамма Л3 с описанными ранее штаммами вируса паротита
3.4. Сравнение полноразмерных последовательностей геномов штаммов Ленинград3 и
ЬгареЬ
3.5. Генотипирование изолятов вируса кори.
3.6. Разработка олигонуклеотидного микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори.
3.6.1. Определение генотип и группоспецифических мутаций в гипервариабельном районе генаЫ вируса кори. Расчет олигонуклеотидных зондов ДНКмикрочипа.Л
3.6.2. Оценка различных платформ для иммобилизации олигонуклеотидных зондов ДНКмикрочипа и оптимизация условий метода
3.6.3. Первичная характеризация разработанного ДНКмикрочипа для генотипирования изолятов вируса кори
4 3.6.4. Валидация метода генотипирования вируса кори с помощью ДНКмикрочипов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ф СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ОТ АВТОРА

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ


Изучение разнообразия генотипов вируса кори, циркулирующих на территории с высоким уровнем охвата населения профилактическими прививками анализ клинических образцов методом ОТПЦР для определения геномной РНК вируса кори определение генотипов изолятов вируса кори, циркулирующих на данной территории. Разработка ДНКмикрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори разработка метода и его оптимизация, используя установленные ВОЗ эталонные штаммы генотипов вируса кори и изоляты дикого типа, выделенные на территории различных стран валидация метода используя панели клинических образцов, собранных от больных корью и лиц, инфицированных другими вирусами, вызывающими экзантемные заболевания определение чувствительности и специфичности разработанного метода. Научная новизна работы. Впервые определены полноразмерные последовательности геномов сибирских изолятов вируса паротита генотипы Си Н. Получена полноразмерная последовательность генома штамма Л3, применяющегося при производстве паротитной вакцины в России. Показана генетическая стабильность и гомогенность штамма Л3. Для обработки данных ДНКмикрочипов при генотипировании изолятов вируса кори впервые применен метод иерархического кластерного анализа. Практическая значимость работы. Выделен и депонирован в коллекцию культур микроорганизмов ГНЦ ВБ Вектор номер V0 штамм вируса паротита ПетроНов генотип Н. Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков генома штаммов вируса паротита. В соответствии с рекомендациями ВОЗ vi i Vi , Женева декабря г. Л3, применяющийся для производства паротитной вакцины в России. Разработан метод генотипирования изолятов вируса кори без использования определения последовательности нуклеотидных остатков участков генома вируса. Положения, выносимые на защиту. Показана стабильность и генетическая гомогенность штамма Л3 вируса паротита, применяемого для производства паротитной вакцины в России. Установлены генетические различия между вакцинными штаммами вируса паротита Л3 Росиия и Хорватия, Индия, Египет. Разработан и апробирован ДНКмикрочип, способный детектировать и эффективно дискриминировать все описанных генотипа вируса кори в клинических образцах. Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях Генодиагностика Инфекционных Болезней Москва, октября г. Публикации. По материалам диссертации опубликованно печатных работ. Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением клинических исследований, получены непосредственно автором. Семейство xvii. Генетические и биологические свойства. Классификация. Общие сведения. Семейство xvii включает в себя оболочечные РНКсодержащие вирусы с отрицательной полярностью генома. Вирусы данного семейства парамиксовирусы имеют близкие к двум другим семействам РНКсодержащих вирусов отрицательной полярности характеристики биологические свойства гликопротеидов их оболочки похожи на таковые вирусов семейства xvii, организация несегментированного генома и его экспрессия подобна вирусам, принадлежащим семейству vii . В году международный Комитет по Таксономии Вирусов IV подразделил семейство xvii на два подсемейства, xvii и vii. Подсемейство vii содержит роды vi и vi. IVix. Парамиксовирусы содержат несегментированные геномы, состоящие из одноцепочечной молекулы РНК отрицательной полярности т. РНК. Вирусы реплицируются полностью в цитоплазме. Длина геномов составляет т. М . На рисунке 1 представлены генетические карты вирусов кори и паротита. МИ . Н шшшшш . Рисунок 1. К. . Для вирусов семейства xvii характерно наличие белка слияния белок , вызывающего процесс слияния вирусной и клеточной мембран при нейтральных значениях . Внутри оболочки в центральной части вириона находятся нуклеокаисиды винтовой формы, содержащие геномную РНК и молекулы нуклеокапсидного белка , фосфопротеина Р и большого белков v С. К.С. В промежутке между оболочкой и внутренней частью вириона находится матриксный М белок, который является важным для архитектуры вириона и освобождается после завершения процесса раздевания вируса Т.