Разработка систем клонирования, обеспечивающих продукцию вирусных антигенов в дрожжах saccharomyces cerevisiae

• Автор: Грудинин, Михаил Павлович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 127 с. : ил

Оглавление
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Экспрессия вирусных генов, кодирующих поверхностные и коровые

белки, в гетерологичных системах Ю

2.2. Вирусоподобные частицы источник вирусных антиг енов и основа высокоспецифичных вакцин нового поколения

2.3. Туретротранспозоныаналоги провирусов ретровирусов

2.3.1. Семейства Туретротранспозонов сходство и различие.

2.3.2. Генетическая организация Ту 1ретротранспозона

2.3.3. Стратегия и продукты экспрессии Туретротранспозона.

2.3.4. Механизмы транспозиции Ту 1ретротранспозона

2.3.5. Транскрипция Туретротранспозона
2.3.6. Формирование вирусоподобных частиц
2.4. Конструирование и использование дрожжевых векторов, обеспечивающих экспрессию гена структурного белка Ту 1 ретротранспозона
2.4.1. Принцип конструирования плазмид на основе генов Ту 1
ретротранспозонов.
2.4.2. Использование гена, кодирующего структурный белок р1 Ту
ретротранспозона дрожжей для конструирования векторов.
2.4.3. Экспрессия гибридных генов, кодирующих химерные белки, состоящие из фрагмента белка р1 и антигена, в дрожжевых
клетках.
3. Материалы и методы
4. Результаты и обсуждение.
4.1. Создание дрожжевой системы экспрессии, секретирующей вирусные
антигены в культуральную среду.
4.1.1. Создание содержащих фрагмент 8а8ро1 генома ВИЧ1 рекомби
нантных плазмид, определяющих секрецию вирусных антигенов клетками 5. сегехшае
4.1.2. Анализ экспрессии фрагментов генома ВИЧ1 дрожжевыми
клетками
4.1.3. Частичная очистка антигенов из культуральной
жидкости.
4.1.4. Иммунологические свойства секретируемых
антигенов
4.1.4.1. Тестирование антигенных свойств продуктов гена , секретируе мых клетками . vii, на охарактеризованной панели сывороток
4.1.4.2. Сравнение антигенных и иммуногенных свойств полученного нами антигена с рекомбинантными
белками ВИЧ1, полученными из различных источников
4.2. Создание дрожжевой системы экспрессии антигенных
детерминант в виде гибридов с фрагментом структурного
белка i Ту 1 ретротранспозона дрожжей.
4.2.1. Определение нуклеотидной последовательности и анализ вторичной структуры РНК гена ретротранспозона
дрожжей . vii Ту 1.
4.2.2. Конструирование дрожжевых векторов, определяющих
экспрессию фрагмента гена Т А
4.2.3. Анализ экспрессии полученных конструкций
4.2.4. Конструирование гибридного гена ДТУААцВГД
4.2.4.1. Клонирование гена антигена вируса гепатита Дельта
4.2А.2. Анализ экспрессии гибридного гена ЛТУААбВГД.
4.2.5. Фракционирование клеточных лизатов, содержащих рекомбинантные белки в сахарозном градиенте
4.2.6. Изучение специфичности антигенных свойств химерного
белка
Выводы
Список литературы


Учитывая, что рекомбинантные вирусные антигены могут быть легко модифицированы сайтспецифическим мутагенезом, могут подвергаться слиянию с суперантигенами и факторами стимуляции иммунного ответа, наличие клонированного рекомбинантного антигена создает возможности целенаправленного конструирования нового поколения рекомбинантных вакцин. Результаты работы могут быть использованы в практических разработках по созданию эффективных систем гетерологической экспрессии в дрожжах. Основные положения, выносимые на защиту. Генноинженерное конструирование дрожжевых рекомбинантных плазмид, содержащих фрагмент или генома ВИЧ1 в рамке считывания лидерного пептида дрожжевого киллерного токсина иод контролем индуцибельного промотора позволяет обеспечить контролируемую секрецию вирусных белков. Конструирование плазмиды и продуцента II обеспечивает секреция белков ВИЧ1 в культуральную среду, что сопровождается накоплением свободного и протеолитически стабильного белка р продукта гена . Сскретируемые в разработанной системе вирусные антигены продукты фрагмента генома ВИЧ1 обладают иммуногенностыо и рядом антигенных свойств, соответствующих свойствам природных структурных белков ВИЧ1, и i быть использованы для создания специфичных диагностических систем. Генноинженерное конструирование челночного вектора, предназначенного для получения гибридных генов на основе фрагмента гена структурного белка ретротранспозона дрожжей . СЛЬСУС промогора, позволяет получать вирусные антигены в различных молекулярных формах. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе по химиотерапии, Берлин, г. Международной конференции Медицинская биотехнология, иммунизация и СПИД, Ленинград, г. Международной конференции СПИД, рак и родственные болезни, СанктПетербург, г. По теме диссертации опубликовано 6 печатных рабо т. Диссертация состоит из введения обзора литературы, включающего четыре главы результатов собственных исследований, включающих разделы Материалы и методы и Результаты и обсуждение, изложенные в двух главах выводы и список литературы. Работа изложена на 7 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, рисунков список литературы содержит 4 наименования на русском и английском языках. Способность ретровирусов формировать вирионы и коровые частицы, а ретротранспозонов ВПЧ широко используется в рекомбинантной ДНКбиотехнологии для получения вирусных антигенов и производства высокоэффективных безопасных вакцин против различных инфекционных агентов. Для этого конструируются биотехнологические системы синтеза поверхностных иили согебелков ретровирусов и пдбныx белков ретротранспозонов в гетерологичиых клетках. Экспрессия вирусных генов, кодирующих поверхностные и коровые белки в гетерологичиых системах. Результаты, полученные в последнее десятилетие в различных научных лабораториях, убедительно доказывают, что поверхностные и коровые белки различных вирусов могут синтезироваться и самособираться в сферические частицы в гегерологичном хозяине, в том числе и в дрожжах 8. Рассмотрим некоторые из известных примеров. БЫоэак с соавторами 8Ыозак1 с ак, сконструировал дрожжевой штамм, который экспрессировал одновременно четыре гена вируса гепатита В, кодирующих три трансмембранных белка белки оболочки и коровый белок под контролем дрожжевых глицероальдегид3фосфат дегидрогеназного промотора и терминатора. В лизатах этих клеток были обнаружены сферические частицы диаметром около нм и плотностью 1, гмл. Эти частицы образовывались в дрожжевой клетке только в том случае, когда синтезировались продукты всех четырех генов. Такие частицы были способны взаимодействовать с антителами против оболочечных белков и не взаимодействовали с антителами против корового белка. Однако после обработки 3 Мошс1е1 Р, разрушающим наружную оболочку частиц, состоящую из оболочечных белков, частицы были способны взаимодействовать с антителами против корового белка. Эти результаты доказывают возможность формирования вириолоподобной структуры или, по крайней мере, се аналога, состоящего из коровой частицы, лишенной ДНК, окруженной оболочечными белками, в гетерологичном хозяине.