Физико-химические свойства надфн-адренодоксин редуктазы и ее роль в гидроксилировании стероидов

• Автор: Арменян, Армен Геворкович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ереван
• Количество страниц: 142 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУЙ

I. Митохондриальные системы гидроксилирования

2. Свойства адренодоксина.

3. Свойства флавопротеинов II

4. Свойства адренодоксинредуктазы

5. Взаимодействие адренодоксинредуктазы с субстратами

6. Реконструкция митохондриальной системы гидроксилирования .

ГЛАВА П.МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

I. Реактивы
2. Приборы.
3. Методы исследования.
4. Выделение и очистка белковых препаратов
4.1. Получение митохондрий из коры надпочечников .
4.2. Очистка адренодоксина.
4.3. Очистка цитохрома с
4.4. Приготовление адренодоксинсефарозы.
4.5. Очистка адренодоксинредуктазы .
4.6. Выход белковых препаратов
4.7. Получение апоформы адренодоксинредуктазы
4.8. Получение апоформы адренодоксина .
ГЛАВА Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ .
I. Реконструкция гидроксилирующей цепи
2. Свойства адренодоксина и его взаимодействие с
стр.
детергентами.
3. Физикохимические свойства адренодоксинредуктазы .
4. Определение триптофановых остатков адренодоксинредуктазы
5. Исследование структуры адренодоксинредуктазы
методом селективного тушения флуоресценции . 6. Влияние НАДФН на триптофановуго флуоресценцию
адренодоксинредуктазы.
7. Взаимодействие адренодоксинредуктазы с адре
нодоксином.
ГЛВА У. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУ


Во всех изученных случаях система гидроксилирования стероидов состояла из трех белков, причем терминальным является цитохром Р0. Кроме цитохрома Р0 во всех митохондриях, способных к гидроксилированию стероидов обнаружены также железосерный белок, аналогичный адренодоксину и флавопротеин, аналогичный по свойствам адренодоксинредуктазе. Поэтому целесообразно более подробно рассмотреть свойства этих компонентов системы гидроксилирования. Ниже рассматриваются имеющиеся в литературе данные о двух компонентах гидроксилирувдей цепи митохондрий кори надпочечников адренодоксине и адренодоксинредуктазе. Акцептором электронов адренодоксинредуктазы в цепи гидроксилирования стероидов является адренальный ферредоксин или адренодоксин. Этот белок состоит из одной субъединицы с молекулярной массой около 0 Да ,. Он впервые был получен из митохондрий коры надпочечников быка Омурой и сотр. Кимурой и сотр. Исследование аминокислотного состава белка показало, что он состоит из 4 аминокислотных остатков, среди которых преобладают остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот . Благодаря этому, адренодоксин является кислым белком с изоэлектрической точкой при 4,2 . Ароматические аминокислоты в адренодоксине представлены 4 остатками фенилаланина и I остатком тирозина. Триптофановых остатков в молекуле белка не содержится. Активный центр адренодоксина представляет собой железосерный кластер, в котором 2 атома железа соединены между собой двумя атомами лабильной серы. Исходя из этого, адренодоксин относят к классу 2Ре2Э ферредоксинов, характеризующихся рядом оходных физикохимических свойств ,. В г. Гиббонсом и сотр. При слабом подкислении лабильная сера легко выделяется в раствор В виде , что приводит к полной деструкции активного центра и потере железа. Окисленная форма белка, подобно другим 2Ре ферредоксинам, характеризуется интенсивной краснокоричневой окраской с поглощением на 8 нм, 5 нм, 4 нм, 0 нм, 0 нм, 2 нм, нм и нм. Коэффициент миллимолярной экстинкции белка на 5 нм равен 9,8 см . Спектрально и электрофоретический гомогенный, максимально очищенный адренодоксин характеризуется отношением, А5А8 0,8. Из препаратов белка с таким оптическим индексом были получены кристаллы игольчатой формы ,, достигающие величины 0,5 мм. Окисленная форма ферредоксинов диамагнитна и не имеет сигнала ЭПР. При восстановлении 2 Ре ферредоксины обесцвечиваются, становясь бледнорозовыми, с характерным оптическим поглощением на 0 нм. Окислительновосстановительное титрование белка показало, что хотя адренодоксин содержит два атома железа, для полного восстановления одной молекулы необходим один электрон. В восстановленном состоянии ферредоксины парамагнитны, характеризуются спектром ЭПР с необычным для низкомолекулярных комплексов железа фактором, 1, . Сигнал имеет ромбическую форму для 2 Ре ферредоксинов растительного происхождения и аксиальную для адренодоксина . Неожиданными оказались флуоресцентные свойства ферредоксинов ,,. Известно, что для тирозина такая длинноволновая флуоресценция может наблюдаться лишь при очень высоких , около II, когда гидроксильная группа тирозина ионизирована . Удаление железосерного активного центра в некоторых случаях приводило к смещению максимума флуоресценции в более характерную для тирозина область максимума флуоресценции . Исследование Кимуры и сотр. Адренодоксин, как компонент гидроксилирушей цепи, принимает электроны от адренодоксинредуктазн, являющейся таким образом, донором электронов для адренодоксина. Этот фермент содержит в активном центре флавиновую простатическую группу, т. Прежде чем рассматривать непосредственно свойства адренодоксинредуктазн, целесообразно кратко охарактеризовать класс флавиновых ферментов. Флавопротеины составляют весьма широкий класс ферментов, функционирующих во многих ферментативных реакциях, осуществляющих как одно, так и двухэлектронные окислительновосстановительные реакции. ЭТИХ 1руш. Оде в ранних работах по флавопротеинам стало известно, что флавиновый кофактор можно удалить из белка без деструкции последнего.