Исследование фосфорилирования Na, К-АТФазы протеинкиназой А

• Автор: Муртазина, Диляра Ахметалимовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с.

Содержание
Список сокращений
Введение
Обзор литературы
1. Общая характеристика №,К-АТФазы
2. Структура 1Ча,К-АТФазы
2.1. Субъединичный состав фермента
2.2. Структурная организация а-субъединицы
Первичная структура, изоформы
Топография а-субъединицы
Структура цитоплазматического домена. Организация активного
центра Иа.К-АТФазы
Структура катион-связывающих центров
2.3. Структурная организация р-субъединицы
2.4. Четвертичная структура Ыа.К-АТФазы
3. Механизм функционирования №,К-АТФазы
3.1. Общая характеристика реакции, катализируемой N8,К-АТФазой
Субстратная специфичность Иа,К-АТФазы
3.2. Частные реакции, обеспечиваемые №,К-АТФазой
Окклюдированные катионы
Основные конформационные состояния Ма,К-АТФазы
3.3. Модифицирующее действие АТФ наИа,К-АТФазу
4. Механизмы регуляции активности Ыа,К-АТФазы
4.1. Участие ИаД-АТФазы в осуществлении различных функций клеток
животных
4.2. Изоферменты Иа,К-АТФазы и их свойства
4.3. Регуляция активности Ка,К-АТФазы за счет взаимодействия с липидным бислоем мембраны
4.4. Долгосрочная регуляция активности 1Ча,К-АТФазы
Регуляция количества молекул Иа,К-АТФазы в клетке
4.5. Краткосрочная регуляция активности Иа,К-АТФазы
Фосфорилирование N а, К-АТФ азы протеинкиназами
4.6. Белки, взаимодействующие с Иа,К-АТФазой
Анкирин
Взаимодействие анкирина сПа,К-АТФазой

Пектины и их влияние на активность Па,К-АТФазы
Мелиттин
Цель и задачи исследования
Материалы и методы
Материалы
Получение имидазольной формы АТФ
I. Препаративные методы
1. Получение очищенного препарата Па,К-АТФ азы из солевых желез утки
2. Выделение каталитической субъединицы ПКА
Получение холофермента ПКА
Получение каталитической субъединицы ПКА
3. Выделение анкирина из эритроцитов крупного рогатого скота
4. Получение фракции микросом Н,К-АТФазы из слизистой оболочки желудка
кролика
П. Аналитические методы
1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН-Па
2. Вестерн-блоттинг
3. Иммунохгшическая идентификация белков, иммобилизованных на
нитроцеллюлозной мембране
4. Аффинная очистка моноклональных антител на протеинА-сефарозе
5. Определение концентрагщи белка
6. Определение активности Ыа,К-АТФазы
7. Определение активности каталитической субъединицы ПКА
8. Фосфорилирование очищенного препарата Па,К-АТФазы из солевых желез
утки под действием ПКА
9. Определение стехиометрии фосфорилирования а-субъединицы N а, К-АТФазы
под действием ПКА
10. Авторадиография
11. Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Па, К- и Н,К-
АТФазы
12. Измерение флуоресценции ФИТЦ-меченых препаратов Па,К- и Н,К-АТФаз
13. Анализ фосфоаминокислот
14. Определение количества гидролизованной АТФ
15. Кинетический анализ ингибирующего действия мелиттина

Результаты и их обсуждение
1. Фосфорилирование а-субъединицы №,К-АТФазы из солевых желез утки под действием ПКА
2. Подбор условий для фосфорилирования активной ИаД-АТФазынз солевых желез
утки под действием ПКА
3. Анализ фосфоаминокислот при фосфорилировании ДаД-АТФазы из солевых желез утки ПКА
4. Влияние фосфорилирования ДаД-АТФазы под действием ПКА на ее активность
5. Фосфорилирование НД-АТФазы из слизистой оболочки желудка кролика под действием ПКА
6. Образование комплекса анкирин-Да Д-АТФаза и его фосфорилирование под действием ПКА
7. Взаимодействие мелиттина с ДаД-АТФазой
8. Влияние антител против (3-субъединицы и конканавалина А на фосфорилирование
ДаД-АТФазы под действием ПКА
Заключение
Выводы
Список литературы

модификация, к которой относится и фосфорилирование различными протеинкиназами. В настоящее время показано, что 11а,К-АТФаза фосфорилируется, по-крайней мере, тремя протеинкиназами: цАМФ-зависимой (ПКА),
Са2+,фосфолипид-зависимой (ИКС) и Са2+-кальмодулин зависимой протеинкиназами.
По имеющимся в настоящее время данным, кроме регуляции ионами-активаторами, активность 1Ча,К-АТФазы находится под контролем других быстродействующих механизмов, обеспечивающих синхронный и быстрый ответ клетки на внешние стимулы. В ряде тканей различные агонисты, действующие на изменение клеточного уровня цАМФ, на уровень и распределение ПКС, на концентрацию эйкозаноидов, модулируют активность Ыа,К-АТФазы. Так, появились данные об участии протеинкиназы А в регуляции активности 1Ма,К-АТФазы в миометрии (Tun, Somogyi, 1988) и ректальных железах акулы (Marver et al., 1986), результаты, свидетельствующие о регуляции этого фермента in vivo дибутирильными производными цАМФ и форболовыми эфирами (Vasilets et al., 1990; Vasilets, Schwartz, 1992), а также данные о том, что эффекты нейромедиаторов и гормонов на активность Ыа,К-АТФазы в нейронах и клетках нефронов могут обеспечиваться за счет ее фосфорилирования протеинкиназами (Aperia et al., 1992; Ibarra et al., 1993; Satoh et al., 1992). In vivo , в ответ на стимуляцию ПКА или ПКС наблюдается или активация, или ингибирование активности фермента (см Bertorello, Katz, 1993), однако механизм действия протеинкиназ на этот переносчик ионов до настоящего времени не изучен. Практически в каждой работе выдвигаются гипотезы о роли фосфорилирования молекулы 1Ча,К-АТФазы, о его возможном влиянии на активность фермента. Тем не менее работ, в которых достоверно продемонстрировано влияние фосфорилирования на активность, мало.
Фосфорилирование Na.K-АТФазы ПКС.
Ка,К-АТФаза является мишенью для фосфорилирования ПКС как in vitro (Lowndes et al., 1990; Bertorello et al., 1991; Beguin et al., 1994; Logvinenko et al., 1996); так и in vivo (Pedemonte et al., 1997). Для а 1-изофермента из Bufo Marinus и крысы были идентифицированы участки, по которым происходит фосфорилирование: они располагаются в N-концевой части а-субъединицы фермента (Beguin et al., 1994; Feschenko, Sweadner, 1995). Вопрос о влиянии фосфорилирования №,К-АТФазы под действием ПКС на активность фермента