Пегилирование рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств

• Автор: Кучумова, Анастасия Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1. Бактериальные аспарагиназы и их свойства

1.1.1. Распространение и противоопухолевая активность

1.1.2. Механизм ферментативной реакции.

1.1.3. Физикохимическая характеристика бактериальных Ьаспарагиназ

1.1.4. Свойства терапевтически значимых Ьаспарагиназ

1.2. Бактериальные аспарагиназы как противоопухолевые препараты, проблемы и перспективы их применения

1.3. Модификация белков полиэтиленгликолем.

1.3.1. Пегилирование и его преимущества

1.3.2.Структура и свойства полиэтиленгликоля.

1.3.3. Биохимия пегилирования

1.3.4. Производные полиэтиленгликоля, применяемые для модификации белков.
1.3.5. Влияние пегилирования на фармакокинетические и фармакодинамические свойства белка.
2. Материалы и методы
2.1. Экспрессия рекомбинантной Ьаспарагиназы и ее выделение.
2.1.1. Культивирование штаммапродуцента и экспрессия фермента
2.1.2. Очистка и выделение Ьаспарагиназы
2.2. Физикохимическая и кинетическая характеристика белка.
2.2.1 .Электрофорез в ПААГДСН геле
2.2.2. Изоэлектрофокусирование.
2.2.3. Определение аспарагиназной активности.
2.2.4.0пределение концентрации белка.
2.2.5. Определение кинетических параметров аспарагиназы
2.3. Модификация аспарагиназы производными полиэтиленгликоля.
2.3.1.Модификация белка 2,4бис ометоксиполиэтиленгликоль бхлорБтриазином.
2.3.2. Модификация аспарагиназы метоксиполиэтиленгликольпнитрофенилкарбонатом
2.3.3. Массспектрометрический анализ
2.4. Определение цитотоксической активности аспарагиназы т у7го.
2.5. Определение иммуногенности аспарагиназы.
2.5.1. Получение специфических поликлональных антител
2.5.2. Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа ИФА.
З.Результаты и обсуждение
3.1. Получение препарата рекомбинантной Ьасиарагиназы
ЕтШа сагоюуога.
3.2. Подбор модифицирующего реагента.
3.2.1. Получение 2,4бис Ометоксиполиэтиленгликоль
бхлорБтриазина.
3.2.2. Получение метоксиполиэтиленгликоль пнитрофенилкарбоната
3.3. Получение пегилированной рекомбинантной аспарагиназы
vii v и оптимизация процесса модификации
3.4. Физикохимическая и кинетическая характеристика модифицированной аспарагиназы vii v
3.5. Стабильность модифицированного фермента.
3.7. Оценка цитотоксической активности ПЭГаспарагиназы i vi
3.6. Характеристика иммуногенности пегилированной аспарагиназы vii v.
4. Выводы
5.Литератур а
Список сокращений
АГ аспарагиназаглутаминаза
БСА бычий сывороточный альбумин
ДИК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОНВ 6диазо5оксоЬнорвалин
ИПТГ изопропилрОтиогалактопиранозид
ИФА иммуноферментный анализ
мПЭГ монометиловый эфир полиэтиленгликоля
МТТ ,5диметилтиазол2ил2,5дифенилтетразолия бромид
ОЛЛ острый лимфобластный лейкоз
ПА А полиакриламид
ПААГДСН полиакриламидный гель с добавлением додецилсульфата натрия
ПЭГ полиэтиленгликоль ТХУ трихлоруксусная кислота
2,2азинобис3этилбензотиазол6сульфонатаммония рекомбинантная аспарагиназа . v аспарагиназа . i ЕсА2 аспарагиназа .i
коммерческий препарат аспарагиназы . i метоксиполиэтиленгликольпнитрофенилкарбонат модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинантная аспарагиназа . v изоэлектрическая точка
Введение


Характеристика иммуногенности пегилированной аспарагиназы vii v. ЕсА2 аспарагиназа . Биологические катализаторы, каковыми являются ферменты, обладают чрезвычайно высокой специфичностью и мощным каталитическим воздействием на различные стороны метаболизма в организме. Поэтому они представляют собой уникальные лекарственные средства, используемые в медицине для лечения заболеваний различной этиологии ,. Бактериальная Ьаспарагиназа Ьаспарагинамидогидролаза КФ 3. Ьаспарагина до Ьаспарагиновой кислоты и аммиака. Длительное время бактериальные аспарагиназы применяются в онкологической практике при комбинированной химиотерапии различных видов лейкозов. В последние годы появились сообщения о положительном эффекте аспарагиназы при лечении болезни Ходжкина, хронической лимфоцитарной лейкемии и меланосаркомы ,,. Механизм противоопухолевого действия аспарагиназы заключается в расщеплении аминокислоты аспарагин, находящейся во внеклеточном пространстве. Для опухолевых лимфобластов аспарагин является незаменимой аминокислотой, без поступления которой в клетку извне нарушается синтез белков и клетка становится неспособной к дальнейшему делению. Таким образом, реализация цитотоксичности аспарагиназы не подразумевает контакта или проникновения активного вещества в опухолевую клетку, что принципиально отличает этот фермент по механизму действия от других цитостатиков 1. Сниженная или полностью отсутствующая активность аспарагинсинтетазы фермента, синтезирующего Ьаспарагин, является отличительной чертой не только лейкемических лимфобластов, но и миелобластов, и целого ряда клеток других опухолей. Большинство здоровых, в том числе гемопоэтических, клеток способно синтезировать собственный аспарагин. Целый ряд аспарагиназ из различных бактериальных штаммов обладает противоопухолевым действием. Так противолейкозную активность проявляют аспарагиназы ii i, ii v, ii i, Vii i, vi и некоторые другие. Однако использование препаратов аспарагиназы в противоопухолевой терапии ограничено различными побочными эффектами, поэтому только два наименее токсичных фермента, а именно аспарагиназы из ii i ЕсА2 и ii i ЕгА, нашли применение в онкотерапии . Причем, наименее токсичными признаны препараты, полученные из ii i, что указывает на важность исследования аспарагиназ рода ii. Тем не менее, даже аспарагиназы штаммов ii вызывают развитие иммунологической гиперчувствительности к аспарагиназе, проявляющееся в диапазоне от слабых аллергических реакций до анафилактического шока . Помимо этого, эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой терапии ограничена довольно низкой стабильностью фермента в физиологических условиях. Таким образом, актуальным является получение модифицированных форм аспарагиназ штаммов ii устойчивых к иротеолитической деградации в крови, обладающих низкой иммунологической активностью при сохранении высокой ферментативной активности. В настоящее время существует ряд различных методов модификации терапевтически значимых ферментов. Одним из наиболее эффективных является химическая модификация белка полиэтиленгликолем ПЭГ, т. Она заключается в физикохимической трансформации, достигаемой соединением нативной молекулы белка с ПЭГ. Применение этого метода позволяет значительно повысить терапевтическую эффективность фармакологических препаратов пептидной структуры. Цель работы состояла в получении модифицированной полиэтиленгликолем рекомбинантной Ьаспарагиназы ЕпнШа сагоючога, обладающей повышенной стабильностью и пониженной иммуногенностью. Ьаспарагиназы пг. Епл. Впервые в качестве объекта для получения пегилированной формы аспарагиназы использован генноинженерный фермент пг. Юога, на основе которого в настоящее время в лаборатории медицинской биотехнологии ГУ НИИ БМХ РАМН проводятся работы по созданию отечественного лекарственного препарата рекомбинантной аспарагиназы. В настоящем исследовании впервые разработана и оптимизирована методика модификации полиэтиленгликолем рекомбинантной Баспарагиназы Егл. Получены экспериментальные данные для пегилированной формы рекомбинантной аспарагиназы Егм.