Синтез эктоина аэробными метилотрофными бактериями: биохимические и генетические аспекты

• Автор: Решетников, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика аэробных метилотрофных бактерий.

1.1. Особенности метаболизма метилотрофных бактерий.

1.2. Центральный метаболизм

Глава 2. Галофильныс микроорганизмы

2.1. Осмоадаптация.

2.2. Гиперосмотический шок.

2.3. Спектр совместимых растворимых веществ

2.3.1. Органические анионные осмолиты
2.3.2. Незаряженные осмолиты.
2.3.3. Цвиттерионные осмолиты
2.4. Системы транспорта осмолитов
2.5. Пути биосинтеза осмолитов.
2.5.1. Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина.
2.5.2. Гены биосинтеза эктоина.
2.6. Гапофильные метанотрофы и метилобактерии
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы исследования.
3.1. Культивирование бактерий
3.2. Получение бесклсточных экстрактов и определение концентрации белка
3.3. Определение активности ферментов
3.4. Выделение и анализ осмопротекторов
3.5. Молекулярнобиологические методы
3.5.1. Выделение геномной ДНК
3.5.2. Выделение РНК и ПЦР с обратной транскрипцией ОТПЦР.
3.5.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
3.5.4. Очистка фрагментов ДНК
3.5.5. Лигирование фрагментов ДНК
3.5.6. Получение компетентных клеток и их трансформация
3.5.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов
3.5.8. Создание праймеров и полимеразные цепные реакции
3.5.9. Коньюгация
3.6. Определение и анализ нуклеотидов
3.7. Клонирование и экспрессия генов.
3.8. Выделение и очистка белков
3.9. Определение физикохимических свойств ферментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 4. Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоииа у метилотрофных
бактерий.
4.1. Накопление эктоина гало и галоалкалофильными метанотрофами.
4.2. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у МекуотсгоЬит асарЬит .
4.3. Экспрессия есАВС генов из Ыт. асарЬит 1 в Е. со
4.4. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у МеуотсгоЬит кепете АМО
4.5. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоииа у МеИуорИаа асаса М8
4.6. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у МеЖуЬрЬака юошея МТ
4.7. Сравнительный анализ генов биосинтеза эктоина у метилотрофных бактерий.
Глава 5. Клонирование и экспрессия генов биосинтеза эктоина из
МекуотсгоЬит асарЬит 1.
5.1. Клонирование и очистка рекомбинантной ДАБамииотрансферазы
5.2. Клонирование и очистка рекомбинантной эктоинсинтазы.
5.3. Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБацетилтрансферазы.
5.4. Клонирование и очистка рекомбинантной аспартаткиназы
Заключение
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ММО цитоплазматический ферментный комплекс, состоящий из трех компонентов гидроксилазы А, редуктазы С и регуляторного белка В. Гидроксилазный компонент представляет собой комплекс X222 0 кДа с молекулярной массой субъединиц кДа а, Р и у кДа, причем а субъединица имеет двуядерный негемовый железный центр i i, . Редуктазиый компонент . Да содержит ФАД и 22ii. Редуктаза акцептирует электроны от НАДН, перенося их на двухжелезный сайт гидроксилазы. Да белок В, не содержит простетической группы и кофакторов, но связывается с гидроксилазным компонентом и необходим для эффективной работы рММО i . Экспрессия растворимой формы ММО определяется содержанием меди в среде культивирования и регулируется на уровне транскрипции . Окисление метанола до формальдегида катализируют метанолдегидрогеназы МДГ, различные у грамотрицательных и грамположительных метилобактерий. НАДФ независимая МДГ впервые найдена у ii . М , , , состоит из двух а кДа и двух Р 8. Да субьедиииц, двух молекул пирролохинолинхинона и одного атома кальция , , характерна для большинства грамотрицательных метилотрофных бактерий. Фермент окисляет первичные спирты и формальдегид, требует ионы аммония или метиламин в качестве активатора, имеет высокий оптимум 9. ФМС или другие искусственные акцепторы, но не пиридиннуклеотиды i viv электроны передаются на цитохром с i . Генетические исследования i x I показали участие генов в окислении метанола , i, . Три из этих генов кодируют структурные белки x кодирует большую , x малую Р субъединицы МДГ, x, кодирует цитохром с первичный акцептор электронов, поступающих от МДГ , . В свою очередь, цитохром окисляется цитохромом С , . Показано, что x является одним из наиболее консервативных структурных генов у метилотрофных бактерий i . Окисление формальдегида. Формальдегид ФА является центральным iметаболитом, поступающим в первичные пути ассимиляции РМФ и сериновый, а также подвергающимся дальнейшему окислению с целью получения восстановительных эквивалентов энергии. СО 2. У метилотрофов формальдегид может окисляться до формиата формальдегиддегидрогеназой ФАДГ. НАДФзависимая ФАДГ присутствует в цитоплазме у Ас. . Фермент является гомотетрамером с молекулярной массой субъединицы кДа и способен окислять, кроме ФА, глиоксаль, гликольальдегид и глицеральдегид. Субстратная специфичность и кинетические свойства ФАДГ регулируются белком 8. Да модифнном , . Кроме того, у Ас. обнаружена мембрансвязаниая ФАДГ содержащая . Фермент, возможно, ассоциирован с электронно. . У метанотрофа i А обнаружена НАДФзависимая ФАДГ, по структуре гена и энзиматическим свойствам отнесена к III классу алкогольдегидрогеназ , . ФАДГ из i ii ОВЗЬ состоит из двух идентичных субъединиц. Акцепторами электронов ФАДГ служили ФМС, феназинэтосульфат и 2,6дихлорфенолиндофенол ДХФИФ. Предполагается, что фермент является гемопротеином, содержащим гем стипа . НАДзависимая ФАДГ обнаружена у метилобактсрий Р1 и i i . . Фермент из . ФАДГ из ii viii V0 является гомотетрамером и в качестве простетической группы, возможно, содержит i . Окисление ФА до СО2, происходящее в диссимиляционной ветви РМФцикла, не связано с участием дегидрогеназ формальдегида и формиата, а представляет собой последовательную цепь реакций, катализируемых синтазой и изомеразой Згексулозо6фосфата, изомеразой фруктозо6фосфата, дегидрогеназами глюкозо6фосфата и 6фосфоглюконата. Последняя дегидрогеназа является декарбоксилирующей. В результате этого циклического пути происходит образование СО2, 2 моль НАДФН и регенерация рибулозо5фосфата, первичного акцептора ФА.