Покоящиеся формы бактерий рода Mycobacterium: получение, биохимические факторы реактивации

• Автор: Шлеева, Маргарита Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

1.1. Анабиоз как явление природы.

1.2. Стресс у бактерий и реакция на него.

1.2.1. Выживание бактерий в процессе длительного голодания.

1.2.2. Стационарная фаза развшгия культуры.

1.2.3. Факторы, определяющие поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ.

1.2.4. Биохимические изменения бактериальной клетки в условиях голодания.

1.2.5. Генетическая регуляция переживания бактериальными клетками неблагоприятных условий.

1.3. Покоящиеся формы неспорулирующнх бактерий.

1.4 Выход бактерий из покоящегося состояния.

1.5. Социальное поведение бактерий.

1.6. Туберкулез и латентность инфекции.

1.6.1. Получение латентных форм i i на экспериментальных животных.
1.6.2. Модели покоящихся форм М. i i vi.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Выращивание бактериальных культур
2.2. Оценка жизнеспособности клеток.
2.3.Определение общего числа клеток ОЧК
2.4. Получение супернатантов для восстановления некультивирусмых форм.
2.5. Получение рекомбинантного фактора .
2.6. Аффинная хроматография с использованием антител.
2.7. Реактивация некультнвируемых форм.
2.8. Измерение численного распределения клеток.
2.9. Флуоресцентная микроскопия.
2 Сканирующая электронная микроскопия.
2 Измерение окислительновосстановительного потенциала.
2 Трансформация культуры М. i.
2 Процедура сокультивнрования.
2 Иммуноферментный анализ.
2 Получение СН, обладающего ингибиторным действием на рост клеток.
2 Тестирование активности ингибирующих супернатантов.
2 Гель фильтрация СН с ингибирующей активностью.
2 Ультрафильтрация СН с ингибирующей активностью.
2 Гидрофобная хроматография.
2 Тонкослойная хроматография ТСХ.
2 Получение фракции липидов из супернатанта с ингибирующей активностью.
2 Ядерный магнитный резонанс ЯМР.
2 Инфракрасная спектроскопия ингибирующего вещества ИВ.
2 Включение радиоактивной метки.
2 Хроматомассспектроскопня.
Глава 3. Результаты.
3.1. Получение некультивируемых форм микроорганизмов семейства i.
3.1.1. Поведение культуры в условиях недостатка питательных
3.1.2. Образование некультивируемых форм культурой i i, как результат действия м но ix факторов.
3.1.3. Формирование покоящихся клеток культурой i i при длительном инкубировании в стационарной фазе.
3.1.4. Микроскопия клеток, проявляющих способность образовывать покоящиеся формы
3.1.5. Образование некультивируемых форм у мутантных клеток М.i.
3.2. Изучение вещества, накапливающееся в культуральной жидкости бактерий при
переходе в некультивирусмое состояние.
3.2.1. Тестирование активности и физикобиологические характеристики ИВ.
3.2.2. Метод очистки.
3.2.3. Исследование структуры.
3.3. Восстановление покоящихся форм.
3.3.1. Разработка процедуры реактивации некультивируемых клеток.
3.3.2. Биохимический анализ супернатантов, проявляющих активирующую активность.
3.3.3. Исследование трансформантов М. i, содержащих плазмиду со встроенным
Глава 4. Обсуждение.
Список литературы
ВВЕДЕНИЕ


Например, в ответ на окислительный стресс активизируется синтез каталазы и супероксидднсмутазы i, . Так же может начаться синтез низкомолекулярных осмопротектантов, таких как тригалоза и бетаин i, , . Кроме того, универсальными белкамизащитниками являются белки i, , , способные металлзависимо связываться с ДНК в комплексы, защищающие ее от деградации iii, . Обычно первоначальным ответом на стрессовый фактор является уменьшение метаболической активности. Если подобное замедление метаболизма длится недолго, бактерия может продолжить нормальную жизнедеятельность, как только окружающие условия становятся оптимальными. Если же подобные процессы заходят достаточно далеко, клетка может перейти в покоящееся состояние, при этом могут возникать высоко специализированные формы, такие как споры для спорулирующих бактерий в этом случае метаболизм не детектируется, или некультивируемые НК клетки для тех микроорганизмов, которые не образуют спор метаболическая активность очень низка. Некультивируемые формы, оставаясь живыми, теряют способность расти в тех условиях, которые оптимальны для нормальных клеток данного вида. Для того, чтобы НК клетки приобрели способность нормально расти, они должны пройти процесс реактивации, который до сих пор остается очень мало изученным, впрочем, как и процесс перехода в НК состояние. В экстремальных условиях изза увеличения энергетических затрат на процессы противостояния неблагоприятным воздействиям клетки обеспечивают свое существование за счет уменьшения использования исходных субстратов на синтез собственной массы. В целом можно предположить, что некультивируемость, это специальная стратегия существования бактериальной клетки, позволяющая ей избежать стресса и сохранить жизнеспособность в самых неблагоприятных условиях. Выживание бактерий в процессе длительного голодания. Известно, что бактерии могут переживать голодание в течение длительного времени Подобное голодное выживание было описано для многих видов микроорганизмов ii i , , ii , , Vii . Выживание при голодании имеет несколько важных физиологических характеристик, которые так же можно применить для описания других типов стресса. При голодании происходит уменьшение и фрагментация клеток, появление ультрамикроформ i, . Наблюдается увеличение отношения, площади поверхности клетки к се объему явление хорошо известное для олиготрофов. Некоторые бактерии выработали специальные формы для переживания условий голодания споры и цисты. Сохранение жизнеспособности зависит от предыстории культуры. Например, после лимитирования роста какимнибудь элемешгом наступало голодание клетки, выращенные при лимитации азотом, выживали лучше, чем клетки, лимитированные источником энергии и углерода глюкозой , i, . В процессе переживания голодания происходит не только изменение количества и размеров клеток, но и перестройка метаболизма i, . Это включает появление систем транспорта с высоким сродством к субстрату, снижение в клетке общего количества белка и нуклеиновых. В качественном, составе белков также происходят изменения некоторые белки исчезают, а появляются другие, которые не обнаруживаются в клетке при. Происходит активизация использования запасных веществ и снижение затрат энергии на нужды поддержания. Однако при голодании часть популяции клеток гибнет, а их компоненты становятся пищей для оставшейся культуры, такого рода явление объясняет феномен криптического роста , . Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в начале голодания клетка резко увеличивает активность метаболизма. Это объясняется тем что приспособление к новым неблагоприятным условиям обитания является активным процессом и требует больших энергетических затрат например, для биосинтеза белков голодания или специфических компонентов клеточной стенки. Добавление антибиотиков в частности хлорамфеникола именно в первый час после начала голодания существенно снижало способность клеток Е. Vii vii переживать недостаток питательных веществ , , . В дальнейшем клетка вынуждена резко снижать скорость эндогенного дыхания. Иногда это сопровождается реорганизацией функционирования дыхательной, цепи.