Биосинтез тирозингидроксилазы и механизмы его регулирования в клетках головного мозга крыс под действием ладастена

• Автор: Садовников, Сергей Валентинович
• Шифр специальности: 03.00.04, 14.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 139 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Модификации гистонов и регуляция работы хроматина

1.1.1. Хроматин.

1.1.2. Ремоделинг хроматина.

1.1.3. Модификации гистонов.

1.1.4. Ацетилирование гистонов

1.2. Метилирование ДНК механизм эпигенетического контроля за функциями клетки

1.2.1. Метилирование ДНК

1.2.2. Ферменты, осуществляющие метилирование ДНК.
1.2.3. Функциональное значение метилирования ДНК
1.3. Фармакологические свойства производного 2аминоадамантана ладастена и механизмы их реализации .
СОБСТ ВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы исследований.
2.1.1. Препарат.
2.1.2. Экспериментальные животные.
2.1.3. Извлечение структур головного мозга крыс.
2.1.4. Бактериальные штаммы и векторы.
2.1.5. Перечень использованных реактивов и материалов.
2.2. Методы исследований
2.2.1. Методы анализа содержания белков.
2.2.1.1. Выделение белков цитоплазмы.
2.2.1.2. Экстракция гистонов.
2.2.1.3. Электрофорез белков.
2.2.1.4. Электроперенос белков из акриламидных гелей на мембранные фильтры блоттинг
2.2.1.5. Гибридизация с антителами.
2.2.1.6. Детекция белков.
2.2.2. Методы исследования экспрессии генов.
2.2.2.1. Выделение суммарной РНК.
2.2. Синтез кДНК с помощью РКзависимой ДНКполимеразы
2.2.2.З. Количественная ОТПЦР в режиме реального времени
2.2.3. Методы исследования метилирования остатков цитозина в ДНК
2.2.3.1. Выделение суммарной ДНК
2.2.3.2. Модификация нуклеотидов бисульфитом натрия.
2.2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
2.2.3.4. Элюция ДНК из агарозных гелей
2.2.3.5. Лигирование продуктов ПЦР
2.2.3.6. Подготовка компетентных клеток.
21. Трансформация компетентных клеток Е.соИ
рекомбинантной ДНК.
2.2.3.8. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.2.3.9. Секвенирование ДНК.
2.2.3 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.4. Определение количественного содержания ЬДОФА и дофамина.
ГЛАВА 3. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ
ВРАЗНЫХ СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛАДАСТЕНА И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ Е РЕГУЛЯЦИИ
3.1. Влияние ладастена на экспрессию гена, белка и активность тирозингидроксилазы и содержание ЬДОФА и дофамина в различных структурах головного мозга крыс.
3.1.1. Вентральная область покрышки, прилежащее ядро
3.1.2. Гипоталамус
3.1.3. Стриатум.
3.1.4. Гиппокамп
3.2. Влияние ладастена на характер метилирования цитозина в промоторной области гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса головного мозга крыс
ГЛАВА 4. МОДИФИКАЦИИ ГИСТОНОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛАДАСТЕНА
4.1. Влияние ладастена на динамику уровня гистондеацетилазы 1 и ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в различных
структурах мозга крыс.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ. П
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


СрОдинуклеотидов в промоторной его области выявлено увеличение частоты деметилирования Срвдинуклеотидов в последовательностях, ассоциированных с сайтами связывания отдельных транскрипционных факторов. Установлено, что ладастен снижает уровень гистондеацетилазы 1 в стриатуме и гиппокампе крыс, а также влияет на содержание ацетилированных форм гистонов ИЗ и Н4 в различных структурах мозга крыс. Научнопрактическая значимость. Установленные геномные и внутриклеточные механизмы действия ладастена подтверждают данные о спектрах фармакологической активности препарата, что определяет целесообразность его использования в клинике при необходимости коррекции ряда состояний. Полученные данные учтены при составлении инструкции по применению ладастена в качестве антиастенического средства. Внедрение результатов исследования в практику. Методические подходы, использованные в данной работе, могут найти применение на этапах доклинического исследования потенциальных лекарственных препаратов с целью уточнения спектра действия и анализа механизмов их активностей. Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций студентам на кафедре общей биологии и генетики Башкирского государственного педагогического университета. Основные положения, выносимые на защиту. НЗ и Н4. Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Молекулярная и клеточная биология 21 П286, Государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ 4, РФФИ Агидель 4, Программы целевых расходов Президиума РАН Поддержка молодых ученых 42. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Ум Съезде Российского общества медицинских генетиков Уфа, 4й Международной конференции Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам Москва, Научнопрактической конференции Новая технологическая платформа биомедицинских исследований биология, здравоохранение, фармация РостовнаДону , , III Съезде Фармакологов России СанктПетербург, . Работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии и генетики протокол от 2 октября г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 9 страницах, содержит 3 таблицы и рисунков и состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов и методов исследования глава 2, результатов исследования и их обсуждения главы 3 и 4, заключения, выводов и списка литературы, включающего 7 источников. ГЛАВА 1. Представление о хроматине как окрашенном содержимом ядра клетки введено в науку еще в г. Хроматин чрезвычайно сложный и динамичный комплекс, в состав которого входят ДНК и белки. В клетках высших организмов вся генетическая информация сосредоточенна именно в хроматине. Избирательное и комбинаторное извлечение информации из ДНК, происходящее на уровне хроматина, а не только сама эта информация, приводят к огромному разнообразию фенотипического проявления наследственного материала. Многие ферменты, участвующие в процессе экспрессии генов, се удвоении при делении клетки, исправлении возникающих при этом ошибок и т. ДНК Карпов, . В состав хроматина входят ДНК, гистоны и неги стоновые белки. Универсальные компоненты хроматина белки гистоны, открыты в г. А. Косселем. По суммарному соотношению они сравнимы с ДНК. Гистоны это небольшие по молекулярной массе белки с высоким содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков лизинов и аргининов, локализованных преимущественно в и Сконцевых неструктурированных областях белка, так называемых хвостах. Гистонам долгое время уделялась решающая роль в процессах регуляции генной активности , . На сегодня известны пять основных типов гистонов , Н2А, Н2В, НЗ и 4 Нот английского i, цифры и буквы обозначают номера фракций при хроматографической очистке гистонов. По своему аминокислотному составу гистоны относят к наиболее консервативным белкам в ряду от простейших до высших.