Изучение биосинтеза трансферрина в печени крыс

• Автор: Тимченко, Николай Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 170 c. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Биологическая роль трансферрина и

строение его молекулы

Глава 2. Биосинтез трансферрина и его регуляция .

Глава 3. Молекулярная организация гена

трансферрина птиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Выделение и характеристика трансферрина . .

4.2. Получение характеристика моноспецифических антител против трансферрина
4.3. Получение радиоактивных 1иммуноглобулинов
4.4. Выделение и фракционирование полирибосом
из печени крысы.
4.5. Связывание 1антител с полирибосомами . .
4.6. Анализ полирибосом, синтезирующих трансферрин
4.7. Выделение высокоочищениой мРНК трансферрина .
4.7.1. Выделение суммарных полирибосом
печени крысы
4.7.2. Непрямая иммунопреципитация ТсТусиетезирующих полирибосом
4.7.3. Выделение суммарной РНК из Тфсинтезирующих полисом .
4.7.4. Выделение полиАсодержащей РНК .
4.8. Мечение препаратов ТфмРНК изотопом . .
4.9. Определение молекулярного веса ТфьРНК .
4 Определение размеров полиА
последовательности в ТфмРНК.
4 Анализ вторичной структуры ТфмРНК .
4 функциональная характеристика ТфмРНК . .
41. Бесклеточная трансляция мРНК
трансферрина
42. Обратная транскрипция ТфмРНК
4 Гибридизация РНКТфнДНК
4 Клонирование фрагментов структурного
гена трансферрина
41. Конструирование рекомбинантных
плазмид на основе рВИ 2
42. Трансформация клеток
рекомбинантными плазмидами
43. Гибридизация колоний с РТфкДНК
44. Выделение рекомбинантных плазмид .
45. Рестрикционный анализ
рекомбинантные плазмид . . .
4 Перенос ДНК на фильтры и гибридизация
с ТфкДНК
4 Дцентификация ТфмРНК гибридизацией
с рекомбинантными ДНК из плазмид рИТ
41. Электрофорез РНК в 1,5 агарозе с
6 формальдегидом .
42. Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр . .
43. Никтрансляция ДНК плазмид рКЕ
44. Гибридизация РНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре, С НИКтранслированной ДНК плазмид
45. Выделение мРНК трансферрина гибридизацией
с рекомбинантными ДНК плазмид
Глава 5. Выделение и характеристика трансферрина
плазмы крови крыс
5.1. Выделение трансферрина
5.2. Оценка гомогенности препаратов трансферрина
5.3. Получение и характеристика антител к Тф . .
стр.
Глава б Характеристика полирибосом печени,
синтезирующих трансферрин.
6.1. Общая характеристика полирибосом крысы . .
6.2. йммунохимическая идентификация Тф
синтезирующих полирибосом печени крысы . .
Глава 7. Информационная РНК трансферрина
7.1. Выделение мРНК трансферрина.
7.2. Гомогенность и размеры молекулы ТфмРИК . .
7.3. Размеры полиАпоследовательностей в
мРНК трансферрина
7.4. Вторичная структура трансферриновой мРНК . .
7.5. функциональная характеристика мРНК
трансферрина .
7.5.1. Характеристика продукта бесклеточной
трансляции ТфмРНК.
7.5.2. Влияние i на трансляцию мРНК
трансферрина .
7.5.3. Синтез и характеристика ДНК,
комплементарной мРНК трансферрина .
7.6. Кинетика гибридизации кДНК с различными
фракциями РНКIII
Глава 8. Клонирование кДНК трансферрина крысы . . .
8.1. Синтез рекомбинантных ДНК, содержащих
последовательности ТфкДНК.
8.2. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид
8.3. Идентификация ТфмРНК блотинггибридизацией
с никтранслированной ДНК плазмид
8.4. Трансляция ТфмРНК, вццелешой гибридизацией
с рекомбинантными ДНК
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМ ЛИТЕРАТУРЫ
СШОК РШТЧХ СОКРЛЩШ
кДНК комплементарная ДнК
п.н. пара нуклеотидов
полиА полиадениловая кислота
полии полиуридиловая кислота
т.п.к. тысяча пар нуклеотидов
тщ тетраметилэтклендиамин
ТГ трансДеррин
ТХУ трихлоруксусная кислота
ЭДГА зтилецциаминттраацетат
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Тф При изучении структуры рецепторов Тф человека, выделенных с помощью моноклональных антител 8, оказалось, что рецептор является белкомдимром, субъединичные цепи которого связаны между собой дисульфидной связью. Молекулярная масса димерного рецептора составляет 00 кД, а молекулярная масса мономерной полипептидной цепи кД. Рецепторы Тф локализованы в плазматических мембранах ретикулоцитов и других клеток. Каждая молекула рецептора может связать две молекулы Тф. По данным анализа кариотипов межвидовых соматических гибридов, ген, кодирующий рецептор Тф, расположен на 3й хромосоме человека 6. Поскольку Тф занимает центральное место в процессах транспорта и метаболизма железа, недостаточность этого белка при различных патологических состояниях нарушения питания и др. Нарушения синтеза Тф и его железосвязывающей способности являются постоянными проявлениями биохимического фенотипа наследственного заболевания человека гемохроматоза 2. Тф и общая способность сыворотки к связыванию железа табл. I. Тф в плазме крови снижена, а содержание ионов повышено не только у гомозиготных больных, но и у их клинически здоровых родственников повидимому, гетерозигот. Обращает на себя внимание тот факт, что у обследованных больных гемохроматозом табл. Тф в кровотоке. Тф, но и вследствие какихто структурных аномалий в молекулах Тф . Иначе говоря, можно предварительно полагать, что гемохроматоз является следствием генетически детерминированной аномалии синтеза и структуры Тф. Прямых доказательств этого положения в литературе пока нет. Кроме гемохроматоза, в литературе описаны редко встречающиеся наследственные атрансферринеши с полным отсутствием или резко выраженной недостаточностью Тф плазмы крови 2. В связи с тем, что активно растущие опухолевые клетки очень интенсивно утилизируют железо, Тф является абсолютно необходимым для роста опухолей фактором. В опытах на клетках опухолей человека показано, что моноклональные антитела к рецептору Тф соединяются с мембранными рецепторами и тем самым блокируют взаимодействие рецептора с Тф 8. Вследствие этого рост опухолевых клеток прекращается. Молекула трансферрина представлена одной полипептидной цепью. Долгое время не удавалось точно установить молекулярную массу Тф. Первые исследования показали, что молекулярная масса этого белка лежит в пределах 00, причем для разных организмов эта величина варьировала ,2. и изучали молекулярную массу трансферрина человека, кролика, лягушки, черепахи и миксин различными методами, включая равновесное ультрацентрифугирование, гельфильтрацию и электрофорез с додецилсульфатом натрия 2. Тф миксины 0. Авторы предполагали, что Тф миксины кодируется нуклеотидной последовательностью, которая затем в процессе эволюции дуплицируется. Данное предположение основывалось также на том, что молекула Тф с молекулярной массой 0 имеет два центра связывания железа. Несмотря на то, что впоследствие данные о молекулярной массе Тф миксины не подтвердились, вопрос о дупликации гена Тф остается в силе. Более того, имеются основания считать, что трансферриновык ген в процессе эволюции дуплицировался см. В настоящее время принято считать, что молекулярная масса трансферрина из сыворотки человека, кролика 2, свиньи , крысы 8, птиц равна 00. Молекула трансферрина имеет один концевой остаток валин для трансферрина человека и крысы 9 и аланин для птичьего трансферрина 3. Трансферрин является гликопротеином, отличительная черта которого состоит в том, что на одну молекулу белка приходится разное количество сиаловых кислот. Тф. Эти формы белка имеют разные изоэлектрические точки 5, и 5, соответственно. Кроме того, существуют и другие формы Тф, различающиеся по содержанию сиаловых кислот. Найдены формы Тф, которые имеют изоэлектрические точки 5, и 6,1 8. Наличие двух форм Тф выявлено также у свиньи , у птиц и у человека 2. Вследствие разного содержания сиаловых кислот молекула трансферрина движется при электрофорезе в виде двух преобладающих компонентов.