Оптико-биосенсорный анализ белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных взаимодействий в реальном времени

• Автор: Гнеденко, Оксана Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Принцип оптикобиосенсорного анализа межмолекулярных

взаимодействий

2.2 Взаимодействие антигенантитело

2.2.1 Методы изучения кинетики реакции антигенантитело

2.2.2 Характеристика поверхностного антигена вируса гепатита В

2.2.3 Характеристика нуклеокапсидного белка вируса гепатита С

2.3 Взаимодействие белоклипид

2.3.1 Методы исследования белоклипидных взаимодействий в мембранной цитохром Р0содержащей
монооксигеназной системе
2.3.2 Мембранные и водорастворимые белки цитохром Р0содержащих монооксигеназных систем
2.4 Взаимодействие олигонуклеотидолигонуклеотид
2.5 Взаимодействие фермент низкомолекулярный лиганд
3 Материалы и методы исследования
4 Результаты исследования и их обсуждение
4.1 Исследование взаимодействия МКАНВвАд
4.2 Исследование взаимодействия НСУсогеАдапЙсоге
4.3 Исследование взаимодействия мембранных и водорастворимых
белков из цитохром Р0содержащих монооксигеназных систем с иммобилизованными фосфолипидными слоями
4.4 Исследование кинетики образования и распада дуплексов
р СЮМ и рСЮЫ
4.5 Исследование взаимодействия МАОзависимых дегидрогеназ
цитозоля с иммобилизованным 5аминоизатином
5 Общее заключение
6 Выводы
7 Литература
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
коп константа скорости ассоциации
ко константа скорости диссоциации
Кд константа ассоциации константа аффинности
константа диссоциации
КМД карбоксиметилдекстран
БСА бычий сывороточный альбумин
поверхностный антиген вируса гепатита В
V, белок нуклеокапсидный белок вируса гепатита С
i антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В
i антитела к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С
МКА моноклональные антитела
ВГВ вирус гепатита В
ВГС вирус гепатита С
24 полноразмерный цитохром Р0 2В
полноразмерная зависимая цитохром Р0 редуктаза
лишенная трансмембранного сегмента укороченная зависимая
цитохром Р0 редуктаза
5 полноразмерный цитохром Ь
5 лишенный трансмембранного сегмента укороченный цитохром Ь
адренодоксин
Р0сат цитохром Р0сат
ДЛФЭ дилауроилфосфатидилэтаноламин
ДСФЭ дистеароилфосфатидилэтаноламин
никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
никотинамидадениндинуклеотид
ГАФД глицеральдегид3фосфатдегидрогеназа
ГФДГ глицерол3фосфатдегидрогеназа
ЛДГ лактатдегидрогеназа
гидроксисукцинимид
1этил33диметиламинопропилкарбодиимид КФБ Кфосфатный буфер
КФБЕ Кфосфатный буфер, содержащий 0, гл Эмульгена
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Специфичная к последовательности модификация одно и двухцепочечных нуклеиновых кислот реакционноспособными производными олигонуклеотидов, способными образовывать соответствующие дуплексы и триплексы, один из наиболее перспективных вариантов антисмыслового подхода к регуляции экспрессии генов Vv, . Олигонуклеотиды и их производные могут быть направлены на матричные РНК с целью ингибирования процесса трансляции, а также на вирусные РНК или одноцепочечные ДНК для контроля процессов репликации или транскрипции. В представленной работе оптический биосенсор был применен для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотидолигонуклеотид. Изатин низкомолекулярный эндогенный непептидный регулятор, обнаруженный практически во всех тканях и биологических жидкостях животных и человека vv . Гловер и др. . Хотя изатинсвязывающие белки обнаружены в мембранной и растворимой фракциях клеток, идентифицировано всего несколько мишеней действия изатина моноаминооксидаза, подтип рецепторов натрийуретических пептидов и растворимая стимулируемая гуанилатциклаза тромбоцитов человека v . vv . Гловер и др. vv . . Однако выявленные мишени действия изатина не могут объяснить всей биологической активности, свойственной этому соединению i viv. В данной работе с помощью оптического биосенсора было изучено взаимодействие иммобилизованного 5аминоизатина с зависимыми дегидрогеназами цитозоля глицеральдегид3фосфатдегидрогеназой ГАФД, глицерол3фосфатдегидрогеназой ГФДГ и лактатдегидрогеназой ЛДГ. Определение с помощью оптического биосенсора кинетических констант образования и распада белокбелковых, белоклипидных и олигонуклеотидных комплексов. В ходе выполнения работы определены константы скорости реакций образования и распада комплексов для следующих пар антигенантитело МЕЗНВвАд, СЕНВвАд, НСУсогеАдСЕ, НСУсогеАдСЕ, НСУсогеАдС1, НСсогеАдВ1. Путем ковалентной иммобилизации фосфолипидов на поверхности аминосилановой кюветы оптического биосенсора созданы стабильные фосфолипидсодержащие биочипы для исследования белоклипидных взаимодействий. Определены константы скорости ассоциациии и скорости диссоциации белоклипидных комплексов ДЛФЕУбЬ5, ДСФЕбЬ5, ДЛФЕбРр, ДЛФЕС12В4, ДСФЕб2В4. Установлено, что глицеральдегид3фосфатдегидрогеназа и глицерол3фосфатдегидрогеназа являются изатинсвязывающими белками. Определены константы скорости ассоциации и диссоциации комплекса 5аминоизатинГФДГ. Показано, что лактатдегидрогеназа не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина. Показана возможность выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в сыворотке крови людей с помощью оптического биосенсора. Это создает основы для разработки диагностических методов, позволяющих детектировать маркеры заболеваний в реальном времени с высокой специфичностью, при этом требуется малое количество анализируемой пробы несколько микролитров и короткое время измерения несколько минут. Создание фосфолипидных биочипов позволяет исследовать кинетические характеристики белоклипидных взаимодействий и моделировать мембранные Р0содержащие монооксигеназные системы. Основные положения диссертации были представлены на ой международной конференции Цитохром Р0 биохимия, биофизика и молекулярная биология Франция, , на 5ом конгрессе Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии Москва, , на 2ом международном конгрессе Биотехнология состояние и перспективы развития. Биотехнология и медицина Москва, , на 2ой международной конференции Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины Москва Плес Москва, . По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 4 тезисов докладов. Работа выполнена в ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке Межведомственной научнотехнической программы Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего и РФФИ фанты 1, 5, .