Факторы регуляции глутаматных рецепторов головного мозга

• Автор: Городинский, Александр Изарович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 206 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. ГЛУТАМАТ НЕЙРОВДИАТОР В ЦНС МЛЕКОПИТАЮЩИХ .

1.1. Доказательства нейромедиаторной роли глутамата в ЦНС млекопитающих. Пресинаптические крите
1.2. Постсинаптические критерии доказательства медиаторной функции глутамата. Классификация глутаматных рецепторов

1.3. Основные глутаматергические пути ЦНС млекопитающих .

1.4. Вовлечение глутаматергических путей в механизмы патогенеза ряда заболеваний ЦНС .

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА УЧАСТКОВ СВЯЗЫВАНИЯ ГЛУТАМАТА

НА СИНАПТИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА . .

2.1. Методологические аспекты определения рецепторного связывания глутамата

2.2. Кинетические параметры связывания глутамата .
2.3. Влияние ионного состава инкубационной смеси
на специфическое связывание глутамата .
2.4. Фармакологические свойства участков связы
вания глутамата
2.5. Молекулярные характеристики солюбилизированных глутаматных рецепторов .
ГЛАВА 3. ЭНДОГЕННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ . .
3.1. Са2 и Сазависимые протеазы.
3.2. Мембранные липиды.
3.3. Гуаниловые нуклеотиды. Связь глутаматных рецепторов с системой циклических нуклеотидов .
3.4. Эндогенные ингибиторы пептидной природы .
ЭКСПЕРИГЛЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Выделение и характеристика синаптических мембран из ткани головного мозга .
4.1.1. Схема выделения мембран
4.1.2. Электронномикроскопический анализ выделенных фракций.
4.1.3. Электрофорез мембранных белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфа
та натрия
4.1.4. Определение активности На, КАТФазы
4.1.5. Определение неорганического фосфата
4.1.6. Определение активности цитохромоксидазы . .
4.1.7. Определение активности глутаглатдекарбоксила з и
4.1.8. Определение содержания белка в пробах .
4.1.9. Выделение синаптических мембран из посмертных препаратов мозга человека
4.1Хранение препаратов синаптических мембран .
4.2. Выделение плазматических мембран клеток
нейробластомы
4.2.1. Культивирование клеток нейробластомы .
4.2.2. Схема выделения плазматических мембран
клеток нейробластомы
4.3. Определение специфического связывания
Ь глутамата
4.3.1. Методика эксперимента и аппаратура
4.3.2. Обработка экспериментальных данных
4.4. Выделение и очистка эндогенного фактора, ингибирующего специфическое связывание
Ьглутамата ФИО.
4.4.1. Получение первичного экстракта ФИС
4.4.2. Осавдение балластных белков
4.4.3. Ионообменная хроматография ФИС наСсжех Аб x2 концентрирование
4.4.4. Гельфильтрация ФИС на ЗерЬ.ас1ех 6 . .
4.4.5. Ионообменная хроматография ФИС на Боуех
АО х 2.
4.4.6. Определение нингидринположительного материала в полученных фракциях
4.5. Характеристика ФИС.
4.5.1. Аналитическая тонкослойная хроматография ТСХ.
4.5.2. Полупрепаративная тонкослойная хроматография .
4.5.3. Анализ аминокислотного состава ФИС на высокочувствительном аминокислотном анализаторе .
4.6. Эксперименты с крысами линии КрушинскогоМолодкиной.
4.7. Статистическая обработка результатов . . .
4.8. Материалы, использованные в исследовании
ГЛАВА 5. СВЯЗЫВАНИЕ 3НЬ ГЛУТАМАТА С ШШИЧЕСКИМИ
МЕМБРАНАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМ ИЗ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС И ЧЕЛОВЕКАIII
5.1. Характеристика синаптических мембран.III
5.2. Характеристика специфического связывания Ьглутамата с синаптическими мембранами коры головного мозга крыс
5.3. Связывание ньглутамата с синаптическими мембранами, выделенными из посмертных препаратов коры головного мозга человека .
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ КАТИОНОВ НА СПЕЦИФИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ VГЛУТАМАТА С СИНАПТИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМ И ПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ .
6.1. Влияние На на связывание нглутамата с синаптическими и митохондриальными мембранами .
6.2. Влияние Са на связывание Нь глутамата с синаптическими и митохондриальными мембранами .
6.3. Связывание нглутамата с плазматическими мембранами гибридных клеток нейробластомы .
ГЛАВА 7. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СВЯЗЫВАНИЯ
3НЪГЛУТАМАТА.
ГЛАВА 8. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОГЕННОГО ФАКТОРА,
ИНГИБИРУЮЩЕГО СПЕЦИФИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ГЛУТАМАТА
ГЛАВА 9. ХАРАКТЕРИСТИКА СВЯЗЫВАНИЯ 3 ГЛУТАМАТА В
МОЗГУ КРЫС ЛИНИИ КРУШШСК0Г0М0Л0ДЕШН0Й И ВЛИЯНИЕ ФИС НА РАЗВИТИЕ У НИХ АУДИОГЕННОГО СУДОРОЖНОГО ПРИПАДКА.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Первым условием для выявления любой нейромедиаторной системы в ВДС является наличие адекватного маркера, специфичного для данной нейронной популяции. В некоторых случаях например, для катехоламинов, ГАМК и ацетилхолина такими маркерами служат непосредственно сами медиаторы или ферменты их метаболизма, выявляемые с помощью гистохимических, иммуногистохимических или рэдисавтографичееких методов в исследуемой ткани мозга 4, 0, 0. В отличие от других нейромедиаторов, глутамат а также такие аминокислоты, как аспартат и глицин участвует в основных метаболических процессах, протекающих практически в любой живой клетке, в связи с чем выбор специфических маркеров для глутаматергических синапсов весьма затруднителен. Одно только наличие глутамата или ферментов его метаболизма таких как глутаматдегидрогеназа, глутаматдекарбоксилаза, глутаматаминотрансфераза и др. Б этом случае для идентификации медиатора пользуются I пресинаптическими критериями,
включающими высвобождение глутамата из окончаний стимулируемых нервных волокон и его высокоспецифичное поглощение в пресинаптической области, и 2 постсинаптическими критериями, основывающимися на постсинаптическом действии глутамата и фармакологической специфичности постсинаптических рецепторов. Одним из важнейших доказательств медиаторной функции вещества является обнаружение факта его высвобождения из нервных окончаний при стимуляции пресинаптических волокон 3. Типичная схема проведения эксперимента включает предварительное насыщение препарата среза нервной ткани или фракции изолированных нервных окончаний меченым экзогенным медиатором, деполяризацию мембраны нервных окончаний с помощью электрической стимуляции или деполяризующих агентов таких как вератридин или взятый в повышенной концентрации К и определения количества высвободившейся метки на фоне измерения уровня спонтанного высвобождения. Иногда для этой цели используется фальшивый медиатор, васпартат, который поглощается и высвобождается нервными окончаниями, но практически не метаболизируется 4. Вместо предварительного насыщения меченым медиатором некоторые авторы определяют высвобождение глутамата, синтезированного из меченого предшественника глюкозы или глутамина 1. С точки зрения интерпретации данных результаты подобных экспериментов представляются более надежными, так как при этом обходятся вопросы внутриклеточного распределения и утилизации экзогенного меченого медиатора. Еще более перспективными в этой связи являются эксперименты с непосредственным выявлением высвобожденного медиатора с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии под высоким давлением ЖХВД. Описанные выше эксперименты проводятся, как правило, на
срезах мозговой ткани или на выделенных препаратах нервных окончаний синаптосом. I определение высвобождения глутамата после электрической стимуляции идентифицированных нервных путей и 2 определение изменений в высвобождении глутамата после разрушения идентифицированных нейронных популяций и, соответственно, нервных окончаний с помощью электролизиса или специфических нейротоксинов таких, как каиновая или иботеновая кислоты. При использовании этих методов необходимо учитывать, что полученные результаты могут отражать неспецифические изменения транспортной функции ткани что обусловливает введение дополнительных немедиаторных контролен, а также разрушение или стимуляцию сразу нескольких нейронных путей. В связи с указанными трудностями, идентификация глутаматергических путей с помощью изучения высвобождения медиатора проводится сравнительно редко, однако, по информативности с этим методом можно сравнить лишь метод фармакологической идентификации действия медиатора, который будет рассмотрен ниже. Как уже указывалось, быстрое выведение избытка медиатора из синаптической щели в глутаматергических нейронах опосредуется системой высокоспецифичного обратного захвата пресинаптическими структурами. Традиционно считалось, что эта система ассоциируется только с высокоспецифичным Иазависимым транспортом глутамата, осуществляемым пресинаптической мембраной нейрона 8, однако в последнее время все большее внимание уделяется транспортным функциям мембраны глиальных клеток.