Репликативное метилирование ДНК в L -клетках мыши

• Автор: Исаева, Людмила Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 166 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Механизм репликации ДНК .

1.1. Скорость репликации ДНК эукариот, единицы репликации .

1.2. Репликативный комплекс эукариот. Мультиферментный комплекс синтеза предшественников ДНК. Функциональная компартментализа

ция дезоксирибонуклеотидов .

1.3. Прерывистый синтез ДНК. Ступенчатость синтеза. Синтез фрагментов Оказаки .

1.3.1. Инициация синтеза фрагментов

Оказаки.

1.3.2. РНКпраймеры фрагментов Оказаки. Гетерогенность РНКпраймеров .

1.3.3. Синтезируются ли фрашенты Оказаки
на обеих или на одной нити ДНК
1.3.4. Ферменты синтеза фрагментов
Оказаки.
1.4. Заполнение брешей и лигирование
1.4.1. Ферменты, участвующие в процессе застройки брешей
ii
1.4.2. Ингибиторы и другие факторы регуляции второго этапа репликации ДНК .
1.4.3. Лигирование фрагментов Оказаки .
2. Синтез хроматина
2.1. Структура хроматина
2.2. Гиперчувствительность новообразованного хроматина к нуклеазам
3
2.3. Структурные особенности хроматина в репликативной вилке
2.3.1. Ступенчатое связывание гистонов
с новообразованной ДНК .
2.3.2. Модификация гистонов коровых частиц незрелых нуклеосом
2.3.3. Дефицит гистона Н1 во фракции незрелых нуклеосом. Формирование мононуклеосом с ДНК укороченной длины .
2.3.4. Конформационные интермедиаты
вновь образованных нуклеосом
2.4. Характер распределения родительских и новообразованных гистонов по хроматину при репликации
2.4.1. Модели расположения родительских и вновь синтезированных гистонов
в вилке репликации.
2.4.2. Анализ распределения новообразованных гистонов в репликативной вилке.
2.4.3. Последовательность взаимодействия вновь образованных гистонов с ДНК
в вилке репликации
2.5. Динамика сборки нового хроматина
3. Энзиматическое метилирование ДНК при репликации
3.1. Механизм метилирования. Содержание пАз в
ДНК эукариот
3.2. Характер метилирования ДНК высших эукариот .
3.2.1. Внутригеномное распределение иАз
Стр.
3.2.2. Последовательности ДНК, метилируемые i viv
3.3. Связь метилирования ДНК и репликации
3.4. Разная чувствительность метилаз к аналогам ингибиторам синтеза и метилирования ДНК
3.5. Метилирование ДНК и структура хроматина.
3.6. Биологическая функция метилирования ДНК у эукариот .
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I Динамика репликации ДНК в клетках мыши в зависимости от плотности клеток в культуральном слое
2. Метилирование фрагментов Оказаки и линкерных участков ДНК. Локализация дополнительного метилирования ДНК.
3. Метилирование ДНК в присутствии изобутилтиоаденозина i III
4. Доступность ДНК в хроматине для бактериальной ДНКметилазы М. II
5. Формирование нуклеосом на фрагментах Оказаки
до их лигирования
6. Репликативное метилирование ДНК в присутствии циклогексимида .
7. Схема репликативного метилирования ДНК
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Ступенчатость синтеза. В году группой японских ученых во главе с Оказаки был открыт прерывистый синтез ДНК 6,7. Большая часть новообразованной ДНК . Т4 после денатурации была выделена в виде коротких цепей ДНК, размером 8I т. Они получили название фрагментов Оказаки. Было установлено, что фрагменты Оказаки синтезируются только в 5 3направлении. Несколько позднее импульсный характер репликации ДНК был обнаружен у самых разных представителей низших и высших эукариот, в том числе и у млекопитающих . Размер фрагментов Оказаки в животных клетках значительно меньше, чем у прокариот и может варьировать от до 0 нуклеотидных остатков в различных клетках. В среднем длина зрелого фрагмента составляет 5 нуклеотидных остатков . Электронномикроскопическое исследование репликативных интермедиатов хромосомной ДНК в растительных и животных клетках на разных стадиях развития позволило обнаружить микропузырьки i сайты инициации синтеза ДНК внутри одного репликона и однонитевые молекулы ДНК 6. Во всех анализированных препаратах размеры микропузырьков пар оснований хорошо сопоставимы с размерами фрагментов Оказаки 0 нуклеотидных остатков. Инициация синтеза фрагментов Оказаки, повидимому, происходит внутри однонитевой инициаторной зоны ДНК . Она располагается между 5концом растущей дочерней нити ДНК и репликативной вилкой. Предполагается также, что размер инициаторной зоны определяется расположением нуклеосом, в частности предвилочной нуклеосомы. Сайты инициации синтеза фрагментов Оказаки локализуются в межнуклеосоыной или линкерной области ДНК хроматина 5,4. Основным аргументом в пользу этой точки зрения является большая доступность линкерной ДНК для ферментов по сравнению с внутринуклеосомной коровой ДНК. Попытки выявить уникальные последовательности ДНК в точках инициации репликации для хромосомной ДНК не дали пока положительных результатов 2. Однако, в области ог1 вируса бу найдена уникальная последовательность из пар оснований. Изменение одной пары оснований здесь приводит к изменению скорости репликации вирусной ДНК 6. Поскольку, с репликацией ДНК тесно связана сборка хроматина, то инициация репликации ДНК на уникальных последовательностях может быть связана с уникальным расположением нуклеосом в этом месте. Уникальность места инициации может определяться и другими особенностями структуры ДНК. Так, в этой области содержится один или более обратных повторов палиндромов 1, способных образовывать шпилечные структуры. РНК полимераза или примаза может избирательно связываться с этими уникальными областями ДНК и транскрибирует их, образуя РНКпраймеры. РНКтзаймеш фрагментов Оказаки. РНКпраймер и одна нить шпильки формируют стабильный ДНКРНК гетеродуплекс, так как в шпильке всегда присутствуют однонитевне выпетливания ДНК. Как показали Сугино с соавт. РНКзатравка инициирует синтез ДНК в виде фрагментов Оказаки. Для работы ДНКполимеразы, синтезирующей фрагменты Оказаки, необходима матрица и свободный Н конец праймерной РНК. По аналогии с бактериальными клетками, РНКДНК ковалентные звенья должны образовываться и у эукариот, так как синтез ДНК в эукариотических системах протекает также фрагментарно. Наиболее убедительное доказательство образования ковалентной связи между РНК и ДНК в процессе репликации получено с помощью переноса меченой фосфатной группы из предшественников ДНК в рибонуклеотидн в результате щелочного гидролиза новообразованной ДНК вируса поли омы 9. Брюн,Вейсбах, показали, что в клетках РНКполимераза I образует инициаторную РНК для синтеза ДНК. В интактных мышиных клетках ЗТ6 Ковальски,Денхард, 4 обнаружили РНКзатравку в коротких фрагментах ДНК пар оснований. Селезеночная экзонуклеаза, специфичная к 5ОН концам преимущественно однонитевых молекул, на более эффективно гидролизует новообразованную ДНК, если ее предварительно обработать щелочью. Оказалось, что около молекул ДНК короче 0 нуклеотидов связаны с праймерной РНК. Хотя РНКпраймеры эукариот не имеют специфической последовательности оснований, они обладают определенной гомогенностью по длине.