Стабилизация олигомерных ферментов без применения носителей

• Автор: Трубецкой, Владимир Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений, встречающихся в диссертации

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ СТАБИЛЬНОСТИ И ИНАКТИВАЦИИ

ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ

1. Особенности проявления функциональной активности олигомерных ферментов.

2. Механизм инактивации олигомерных ферментов.

3. Молекулярные основы стабильности олигомерных ферментов из термофильных микроорганизмов

Глава П. СТАБИЛИЗАЦИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ БЕЗ ПРИМЕНЕНИЯ НОСИТЕЛЕЙ.

1. Стабилизация ферментов путем одноточечной модификации поверхностных функциональных групп
2. Стабилизация олигомерных ферментов эффекторами.
3. Стабилизация олигомерных ферментов с помощью солевых мостиков.
4. Стабилизация олигомерных ферментов с помощью внутримолекулярного сшивания бифункциональными реагентами
Глава Я. ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
МАТЕРИАЛЫ.
МЕТОДЫ 4 Ь
стр.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Термостабильность препаратов ГАФД с ковалентно сшитыми субъединицами.
2. Стабилизация ГАФД обработкой бифункциональными реагентами по отношению к различным денатурирующим воздействиям.
3. Механизм стабилизации олигомерных ферментов бифункциональными реагентами
4. Термостабильность препаратов ГАФД, измеренная с помощью регистрации ферментативной активности при повышенной температуре
5. Сравнение стабильности ГАФД с поперечносшитыми субъединицами и ферментов из термофильных микроорганизмов
6. Стабилизация ьаспарагиназы с помощью ковалентного сшивания субъединиц
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Именно поэтому получение искуственно стабилизированных производных ферментов является одной из важнейших задач инженерной энзимологии. В основе процессов инактивации ферментов могут лежать явления различной природы для ряда причин например, ингибирования ионами тяжелых металлов, окисления существенных функциональных групп белка и т. Этот же фактор инактивации играет важную роль при использовании ферментов в качестве лекарственных средств. Наиболее популярным и исторически первым методом преодоления названных препятствий является иммобилизация ферментов на нерастворимых и растворимых носителях различной природы. Ряд исследований последнего времени показал, что ферменты, иммобилизованные на различных полимерах, частично освобождены от нежелательных свойств, присущих нативным ферментам 7 . Однако, в ряде случаев это не является полным решением проблемы. Дело в том, что при практическом применении иммобилизованных ферментов, особенно в медицине, наличие объемной полимерной матрицы может серьезно сказаться на взаимодействии ферментов с высокомолекулярными субстратами и компонентами клеточных мембран, что ставит задачу стабилизации ферментов без применения носителей. Ранее в нашей лаборатории были разработаны подходы к стабилизации ферментов без использования полимерных носителей на примере простейшего модельного фермента химотрипсина в,9 . Они заключались в одноточечной модификации определенных функциональных групп на поверхности белковой глобулы, а также в применении бифункциональных реагентов в качестве скобок, скрепляющих отдельные части полипептидной цепи и фиксирующих таким образом активную конформацию глобулы. Но наряду с подобными химотрипсину одноцепочечными ферментами в природе существует множество более сложных по структурной организации белков, а именно субъединичных ферментов, состоящих из нескольких полипептидных цепей, соединенных в каталитически активный агрегат нековалентными связями ю . Как показали исследования последних лет. Очевидно, можно ожидать существенного повышения стабильности подобных систем, если попытаться какимлибо искусственным способом скрепить субъединицы олигомерного фермента между собой и таким образом предотвратить диссоциацию. Осуществить подобную идею можно было бы химической модификацией олигомерного фермента с помощью бифункциональных реагентов, отлично зарекомендовавших себя в случае стабилизации одноцепочечных ферментов 8,9 при условии связывания между собой двух соседних субъединиц одной молекулой подобного реагента. Хотелось бы отметить, что, помимо практического значения, проблема стабилизации сложных олигомерных ферментов важна еще и в теоретическом плане как особый подход к изучению структуры и функции биокатализаторов и, что особенно важно, механизмов их денатурации. Для детального изучения процесса стабилизации олигомерных ферментов с помощью обработки бифункциональными реагентами была выбрана следующая общая схема работы. На первом этапе работы общие подходы и методики отрабатываются на модельном объекте обычно выбирается хорошо изученный фермент, для которого получаемые результаты можно было бы легко интерпретировать. Второй этап работы заключается в перенесении отработанных на модельном объекте подходах на другие объекты, имеющие непосредственное практическое применение. В предлагаемой работе мы попытались выяснить, в какой степени результаты, полученные в процессе изучения стабилизации простых одноцепочечных ферментов можно перенести на более сложно организованные олигомерные белки. Прежде чем обсудить имеющиеся в литературе данные касающиеся особенностей инактивации и стабилизации олигомерных ферментов, необходимо отметить следующее. По вопросам, затронутым в настоящем обзоре, выполнено огромное количество работ, в которых исследователи имели дело с различными объектами. Нас, однако, в первую очередь, интересовали работы, выполненные с глицеральдегид3фосфатдегидрогеназой и ьаспарагиназой т. Поэтому им и уделено первостепенное внимание в Обзоре литературы.