Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы

• Автор: Куликов, Андрей Валентинович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

Введение

Цель и задачи работы, научная и практическая новизна. .

Часть I Обзор литературы.

Глава 1 Типы клеточной смерти. Внутриклеточные посредники регуляции жизнеспособности клеток.

1.1 Некроз и апоптоз

1.2 Регуляция апоптоза. Семейство белков Вс. .

1.3 Роль белка Р при апоптозе .

1.4 Сигнальная функция внутриклеточных ионов Са2.

1.5 Сигнальная функция активных форм кислорода, окислительный стресс в мозге

1.6 Серинтреониновые протеинкиназьт , РКА, РКВ, РКС . .

Глава 2 АТФаза и глутаматные рецепторы

2.1 АТФаза как ионный насос и участник сигнальных каскадов.
2.2 Рецепторы глутаматергической системы
2.3 Функциональная взаимосвязь между глутаматными рецепторами и АТФазой
Глава 3 Биологические модели, использованные в работе
3.1 Клеточная культура нейробластомы человека 5НБУ5У.
3.2 Линия мышей с ускоренным старением 5АМР .
Часть II Материалы и методы
1 Культура клеток нейробластомы человека БН5У5У
2 Получение суспензии выделенных нейронов быстростареющих мышей
3 Определение нуклеотидных последовательностей
методом полимеразной цепной реакции ПЦР,
4 Приготовление клеточных лизатов
5 Определение белка в клеточных лизатах .
6 Разделение белков электрофорезом и Вестерн блоттинг
7 Определение уровня внутриклеточного кальция, активных форм кислорода
и типа клеточной смерти методом проточной цитометрии
8 Статистическая обработка данных.
Часть III Результаты.
Глава 1 Участие ЫаКАТФазы в сигнальных механизмах клеток нейробластомы человека БН5У5У.
1 Определение изоформного состава АТФазы в клетках 5Н5У5У.
2 Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы БНЗУбУ при действии уабаина.
3 Активация уабаином внутриклеточных белковпосредников в клетках нейробластомы 5Н5У5У
3.1 Активация уабаином р МАРК 2 протеинкиназы.
3.2 Активация протеинкиназы В РКВ, киназа под действием уабаина
3.3 Активация уабаином про и антиапоптозных белков.i.
3.4 Определение типа клеточной смерти при действии уабаина на клеточной культуре РС
3.5 Уабаин препятствует дифференцировке клеток нейробластомы 5Н5У5У под воздействием ретиноевой кислоты РК.
Глава 2 Сигнальные механизмы с участием рецелторов в клетках нейробластомы человека БНЗУбУ.
1 Определение субъединиц рецепторов в клетках 5НБУ5У .
2 Действие на уровень внутриклеточного кальция и АФК.
3 Активация лротеинкиназ р МАРК и РКВ при действии .
Глава 3 Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии .
Часть IV Обсуждение .
1 Участие АТФазы в сигнальных механизмах клеток 6Н5У5У.
2 Сигнальные механизмы с участием рецелторов в клетках 6НУ5У
3 Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии
Часть V Выводы
Часть VI Список литературы . .
Слова благодарности
Список сокращений
1аминоциклопентан1,3дикарбоновая кислота АМРА аамино3гидрокси5метил4изооксазолпропионовая кислота сАМР циклический лоносроссрат, 5 бычья сыворотка 2,7iii i
i , рецепторы сопряженные с белками I,II,III метаботролные глутаматные рецепторы 1,,1 групп
i i, линии быстростареющих мышей Ыметиласпартат АФК активные формы кислорода
БСА бычий сывороточный альбумин vi i
КТС кардиотонические стероиды ТТЦР полимеразная цепная реакция РА ретиноевая кислота
Интернет Сайты
.x.
.i.

.ii.
.ii.

.i.
.ivi.
.i.
.i.
.ii.

Введение


Выбор в качестве объекта клеточной культуры нейробластомы 5 связан с тем, что она является распространенной моделью нервных клеток и часто используется в нейрохимической литературе. Опухолевые клетки являются удобным объектом для изучения как имеющие нервное происхождение именно такой культурой и является клеточная линия нейробластомы 5. Второй объект исследования
животные характеризуются повышенным стационарным уровнем АФК окислительный стресс, поэтому экзайтотоксические механизмы в их мозге представлены в наиболее выраженном виде. Мы предполагали, что сопоставление данных, полученных на культуре клеток и на свежевыделенных нейронах позволит получить более объективную информацию о реальных процессах клеточной сигнализации в нервной ткани. В соответствии с этим, первая часть работы посвящена изучению сигнальных каскадов с участием ЫаКАТФазы и глутаматных рецепторов ЫМАкласса на клеточной культуре нейробластомы БНБУ5У. Вторая часть работы выполнена на нейронах быстростареющих мышей и посвящена взаимодействию ионотропных ЫМОАрецепторов с различными классами метаботролных глутаматных рецепторов. Целью исследования явилось изучение участия ЫаКАТФазы, глутаматных рецепторов ЫМвАкласса и метаботропных глутаматных рецепторов в проведении внутриклеточных сигналов выяснение их роли в регуляции клеточного метаболизма и значения для жизнеспособности нейрональной клетки, а также выявление механизмов взаимодействия этих
систем. Определение изоформного состава ЫаКАТФазы и субъединиц ЫМЬАрецелторов в клетках нейробластомы БНБУ5У. Оценка влияния ЫаКАТФазы и ЫМЬАрецепторов на внутриклеточный уровень ионов кальция и активных форм кислорода АФК в клетках нейробластомы 5НБУ5У. Выявление внутриклеточных белковпосредников, участвующих в механизмах клеточной сигнализации, реализующихся при участии ЫаКАТФазы и ЫМОАрецепторов в клетках нейробластомы БНБУ5У. Оценка жизнеспособности клеток нейробластомы БНБУ5У при блокаде ЫаКАТФазы уобойном и действии токсических концентраций ЫМОА. Выявление типа клеточной смерти некроз или апоптоз при ингибировании ЫаКАТФазы уабаином на клеточной линии РС3. Сопоставление уровня АФК и темпов гибели нейронов мозжечка быстростареющих мышей линии 5АМР АссгегоЛе6 i при активации глутаматных ионотропных и метаботролных рецепторов. Исследования сигнальных процессов, в которые вовлекаются АТФаза и глутаматные рецепторы, на изучаемых объектах до сих пор не проводились. В клеточной культуре нейробластомы 5 присутствуют все 3 изоформы каталитической субъединицы АТФазы. При ингибировании АТФазы уабаином наблюдается увеличение уровня АФК и внутриклеточных ионов кальция, которые, вероятно, участвуют в передаче сигналов в качестве вторичных мессенджеров. На клетках нервного происхождения впервые получены данные об активации АТФазой сигнальных путей с участием протеинкиназ МАРК и РКВ. Впервые обнаружено, что действие уабаина приводит к фосфорилированию белка и подавлению его проапоптозного действия. Одновременно выявлена активация ряда внутриклеточных посредников, участвующих в развитии апоптоза в этих клетках снижается доля активных фосфорилированных белков Вс и x, подавляющих выход цитохрома С из митохондрий в цитоплазме клеток появляется цитохром С, активируется каспаза 3 и белок р. Два противоположных пути регуляции характеризуются различной чувствительностью к уабаину первый выявляется при низких, а второй при высоких 1 мкМ и выше концентрациях этого лиганда. Показано, что в клетках нейробластомы 5 присутствует 1 субъединица рецепторов, но инкубация клеток с не приводит к увеличению уровня АФК и ионов Са2 Тем не менее, в этих условиях
активируются МАРК и РКВ киназы. Возможно, что именно 1 субъединица рецепторов ответственна за их сигнальную функцию. Данные, полученные на мышах линии , демонстрируют регулирующее действие метаботропных глутаматных рецепторов на рецепторы, выражающееся в том, что метаботропные рецепторы I группы ослабляют, а III группы усиливают токсическое действие . Обнаруженные закономерности помогают уточнить молекулярные механизмы сигнальной функции АТФазы и рецепторов глутаматергической системы в нервных клетках.