Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс

• Автор: Свиридов, Максим Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литерату ры

1.1. Развитие оксидативного стресса в гепатоцитах

1.1.1. Образование активных форм кислорода в клетках печени

1.1.2. Свободнорадикальное окисление биомолекул

1.1.3. Роль свободных радикалов при патологии

1.2. Антиоксидантная защита организма

1.2.1. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на свободнорадикальное окисление

1.2.2. Глутатион регулятор ферментативной антиоксидант

ной системы
1.2.3. Антиоксидантные ферменты клеток и их роль в регенерации гепатоцитов
1.3. Нарушение процессов метаболизма глюкозы в клетке при оксидативном стрессе
1.4. Функционирование нентозофосфатного пути при оксидативном стрессе
1.5. Токсическое повреждение печени как модель активации свободнорадикальных реакций
1.5.1 Механизм действия четыреххлористого углерода
1.5.2. Механизм действия гидразина
1.6. Общая характеристика 6фосфоглюконатдегидрогеназы
1.6.1. Катализируемая реакция
1.6.2. Структура и молекулярная масса фермента
1.6.3. Локализация 6фосфоглюконатдегидрогеназы
1.6.4. Методы очистки 6фосфоглюконатдегидрогеназы
1.6.5. Кинетические свойства 6фосфоглюконатдсгидрогеназы и регуляция ее активности
1.6.5.1. Влияние концентрации субстрата и кофермента на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы
1.6.5.2. Зависимость 6фосфоглюконатдегидрогеназной реакции от температуры и
1.6.5.3. Активаторы 6фосфоглюконатдегидрогеназы
1.6.5.4. Ингибиторы 6фосфоглюконатдегидрогеназы
ГЛАВА 2 Объект и методы исследования
2.1. Объект исследования
2.2. Создание модели интоксикации крыс четыреххлористым углеродом
2.3. Создание модели интоксикации крыс сульфатом гидразина
2.4. Получение субклеточных фракций гепатоцитов
2.5. Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления методом биохемилюминесценции
2.6. Оценка степени окислительной модификации белков
2.7. Определение концентрации восстановленного глу гатиона
2.8. Определение активности ферментов
2.9. Определение количества белка
2 Выделение и очистка 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс
. Экстракция
. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония
. Г ельфильтрация на сефадексе 0
. Ионообменная хроматография на ДЭАЭцеллюлозе
. Концентрирование фракций фермента
. Гельхроматография на ТоуореагТУ 2 Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента
2 Аналитический электрофорез
2 Определение молекулярной массы фермента
2 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Сравнительная оценка интенсивности свободнорадикальных процессов и активности 6фосфоглюконатдегидрогсназы в динамике развития токсического поражения печени крыс
8 3.1. Параметры биохемилюминесценции в печени и сыворотке крови крыс в динамике развития интоксикации под действием СС и сульфата гидразина
3.2. Изменение активности аконитатгидратазы при развитии токсического поражения
3.3. Определение содержания карбонильных групп в белках при интоксикации крыс гепатотропными агентами
3.4. Изменение активности дегидрогеназ пентозофосфатного пути при развитии оксидативного стресса
ГЛАВА 4. Кинетические и регуляторные свойства 6фосфоглюконатдегидрогеиазы из печени крыс в норме и при интоксикации СС
4.1. Исследование субклеточной локализации 6фосфоглюконатдегидрогеназы
4.2. Очистка 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс
4.3. Молекулярная масса 6фосфоглюконатдегидрогеназы
4.4. Исследование кинетических параметров каталитического действия 6фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при
интоксикации ССЦ
4.5. Влияние концентрации ионов водорода на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при развитии токсического гепатита
4.6. Регуляторные свойства 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при патологии
4.6.1. Участие ионов некоторых металлов в регуляции активности 6фосфоглюконатдегидрогеназы
4.6.2. Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода
4.6.3. Влияние глутатиона на скорость протекания 6фосфоглюконатдегидрогеназной реакции в печени контрольной и опытной групп крыс
4.6.4. Влияния нуклеотидов на активность фермента
4.6.5. Влияние ди и трикарбоновых кислот на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации крыс ССЦ
4.6.6. Влияние метаболитов углеводного обмена на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс ГЛАВА 5. Кинетические и регуляторные свойства 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации сульфатом гидразина
5.1. Очистка 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации сульфатом гидразина
5.2. Исследование кинетических параметров каталитического действия 6фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации сульфатом гидразина
5.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы при интоксикации сульфатом
гидразина
5.4. Регуляторные свойства 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации крыс сульфатом гидразина
5.4.1. Участие ионов некоторых металлов в регуляции активности 6ФГДГ
5.4.2. Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода
5.4.3. Влияние глутатиона на скорость протекания 6фосфоглюконатдегидрогеназиой реакции при интоксикации крыс сульфатом гидразина
5.4.4. Влияния нуклеотидов на активность фермента
5.4.5. Влияние ди и трикарбоновых кислот на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы при интоксикации сульфатом гидразина
5.4.6. Влияние метаболитов углеводного обмена на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс в условиях введения сульфата гидразина
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


На основе полученных результатов сделано заключение, что в условиях интоксикации гепатотоксинами 6ФГДГ, повидимому, не играет существенной роли в поставке для ГРГПсистемы, которая может обеспечиваться другими генерирующими ферментами в частности, Г6ФДГ и изоцитратдегидрогеназой. Предложена гипотетическая схема возможного участия 6ФГДГ в лимитировании СР процессов, путем снижения скорости образования короткоцепочечных сахаров. Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании 6ФГДГ в условиях нормы и при патологии. Исследование особенностей метаболитной регуляции 6ФГДГ в условиях оксидативного стресса, развивающегося при токсическом поражении печени, может способствовать выяснению причин патогенеза на клеточном уровне и поиску путей коррекции патологического состояния в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также могут применяться в научноисследовательской практике при выделении других ферментов из различных тканей млекопитающих, при моделировании биохимических процессов i viv для изучения кинетики сопряженных реакций в полиферментных системах. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ. Результаты работы использованы при выполнении гранта по научной программе Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук Университеты России УР. Министерства образования и науки РФ Развитие научного потенциала высшей школы РНП. Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 9ой и ой Пущинской школеконференции молодых ученых Биология наука го века Пущино, , , III Съезде биофизиков России Воронеж, , VIII Международной научной экологической конференции Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем Белгород, , IV Международной научнопрактической конференции Медицинская наука XXI века Витебск, , ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета Воронеж, ,. Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях в 3 статьях и 5 тезисах. ГРГП АОС. С использованием гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ показано, что при поражении печени гепатотоксинами происходят изменения кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности фермента под действием ионов некоторых металлов, интермедиатов цикла Кребса, метаболитов углеводного обмена и нуклеотидфосфатов. При интоксикации гепатотоксинами имеет место ряд особенностей регуляции активности 6ФГДГ, которые могут способствовать торможению функционирования фермента возникновение ингибирующего действия окисленного глутатиона, снятие активирующего эффекта изоцитрата и . Структура и объем работы. Диссертация представлена на 0 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Иллюстративный материал включает рисунка и 8 таблиц. В приложении содержатся рисунков и 3 таблицы. ГЛАВА 1. Н2О2 пероксид водорода, ОН гидроксильный радикал. К активным формам кислорода также относят синглетный молекулярный кислород , иергидроксильный радикал Н, гипогалоиды, пероксидный радикал 1Ю2 и другие 5,, ,. Одноэлектронное восстановление приводит к образованию супероксидного анионрадикала или его протонированной формы гидропероксидного радикала Н. Время жизни супероксидного анионрадикала составляет 6 с. Его биологическое действие заключается в индукции пероксидного окисления липидов ПОЛ, разрушении мембран эритроцитов, образовании гидроксильного и пергидроксильного радикалов. Тушителями супероксидного анионрадикала являются супероксиддисмутаза СОД, аскорбиновая кислота, церулоплазмин ,. Пероксид водорода стабильный продукт, легко проникает через мембрану.