Идентификация молекулярной формы церулоплазмина, локализованной в митохондриях крысы

• Автор: Васин, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 0 с. : 136 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая роль ионов меди.

1.2. Метаболическая система меди

1.3. Церулоплазмин.

1.3.1. Структура гена ЦП

1.3.2. Структурнофункциональная организация церулоплазмина.

1.3.3. Основные функции ЦП

1.3.4. ЦП белок категории ii i.

1.3.5. Церулоплазминподобные белки.
1.4. Современные представления об информационной емкости
природных генов
1.4.1. Альтернативная транскрипция
1.4.2. Альтернативный сплайсинг.
1.4.3. Транссплайсинг
1.4.4. Альтернативное полиаденилирование
1.4.5. Редактирование.
1.4.6. Регуляция на уровне трансляции.
1.4.7. Альтернативные сайты инициации трансляции
1.5. Митохондрии
1.5.1. Общие представления о структуре и функции митохондрий
1.5.2. Транспорт белков в митохондрии.
1.5.2.1. Сигнал доставки белков в митохондрии.
1.5.2.2. Митохондриальные транслоказы.
1.5.2.2.1. Транслоказа наружной мембраны ТОМ.
1.5.2.2.2. Транслоказы внутренней мембраны I.
1.5.2.З. Факторы транслокации.
1.5.2.4. Механизм доставки белков в митохондрии.
1.5.2.5. Разнообразие способов импорта белков в митохондрии
ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные методы.
2.1. Экстракция тотальной РНК.
2.2. ОТПЦР анализ
2.3. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля и
секвенирование продуктов амплификации
2.4. Получение субклеточных фракций методом дифференциального центрифугирования из тканей крысы
2.5. Получение митохондрий методом дифференциального
центрифугирования из тканей крысы для изучения переноса Р белков.
2.6. Получение митохондрий, лизосом и пероксисом методом
изопикнического центрифугирования
2.7. Получение субмитохондриальных фракций
2.8. Оптимизация системы достройки полипептидов ЦП i vi
2.9. Реконструированная система для импорта белков в
митохондрии
2 Перенос 1ЦП крови в митохондрии
2 Связывание ЦП с митохондриями.
2 Получение митопластов
2 Общие методы.
Компьютерные программы, использованные в работе
ЧАСТЬ 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Компьютерный поиск мРНК, потенциально кодирующих
ЦП митохондриальной локализации.
3.2. Выявление иммунореактивных полипептидов ЦП в
субклеточных фракциях мозга
3.3. Теоретический анализ предполагаемой изоформы мтЦП
3.4. Идентификация мтЦПмРНК методом ОТПЦР.
3.5. Синтез и накопление предсказанного мтЦП в цитозоле
клеток печени и его перенос в изолированные митохондрии
3.6. Перенос 1ЦП крови в изолированные митохондрии
3.7. Связывание ЦП крови с митохондриями
3.8. Поиск внутримолекулярного С ДМ.
3.9. Возможная биологическая роль митохондриального ЦП
3 Митохондриальный ЦП у других видов млекопитающих
3 Филогенетический анализ мультимедных голубых белков.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Поэтому идентификация и характеристика новых изоформ ЦП млекопитающих, которая, безусловно, будет способствовать лучшему пониманию его биологической роли, является актуальной задачей. Цель исследования состояла в теоретическом анализе информационной емкости хромосомного гена ЦП крысы, экспериментальной проверке существования предсказанных транскриптов и определении локализации их предполагаемых белковых продуктов. ЦПмРНК в составе тотальной клеточной РНК. Научная новизна полученных результатов. Методами теоретического анализа генома крысы предсказано существование новой изоформы ЦПмРНК, белковый продукт которой может быть локализован в митохондриях. Методом ОТПЦР со специфическими для предсказанной мРНК праймерами и последующим прямым секвенированием ПЦРпродукта показано, что эта мРНК присутствует в печени, мозге и семенниках. Белковые продукты, потенциально соответствующие этой мРНК, обнаружены в матриксе митохондрий методом иммуноблотинга. В реконструированных системах i vi показано, что в клетках печени синтезируется и освобождается в цитозоль полипептид ЦП, который может быть импортирован в митохондрии. Импорт мтЦП нуждается в цитозольных факторах и энергозависим. Предложена модель пути эволюции ЦП, учитывающая существование ЦПподобного внутриклеточного мембраносвязанного белка у С. Научнопрактическая значимость результатов исследования. Полученные результаты расширяют представления об информационной емкости хромосомного гена ЦП крысы и механизме экспрессии этого гена на уровне транскриптома и протеома. Вносят новый вклад в представления о биогенезе митохондрий, метаболизме меди и железа в органеллах. Они также будут способствовать пониманию путей развития нейродегенеративных заболеваний, зависимых от функции митохондрий, и механизмов, лежащих в основе апоптоза, опосредованного митохондриями. Альтернативная транскрипция гена ЦП крысы с предсказанного промотора, расположенного в интроне 2. В клетках печени синтезируется 0кДа полипептид ЦП. ЦП импортируется в митохондрии в энергозависимой манере в присутствии цитозольных факторов. Предложена уточненная схема эволюции белков семейства мультимедных оксидаз. Апробации результатов работы. Результаты работы доложены на ой Европейской конференции молодых ученых по биологии и медицине. Берлин. Германия. Международном Конгрессе по генетике человека. Мюнхен, Германия. Международном Конгрессе по генетике человека. Прага. Чехия. Пущинской школеконференции молодых ученых Биология наука XXI века. Пуишно. Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике. Киев. Украина, сентября, г. СПб Отделения Всероссийского биохимического общества, июня июля г. Международной конференции I Биология после генома физический взгляд, Сарагоса, Испания, февраля . Личный вклад соискателя. Планирование теоретического поиска, выбор экспериментальных подходов, получение основной части результатов, их обсуждение и написание статей выполнены соискателем. Высокоочищенный препарат ЦП крови крысы получен аспирантом Отдела молекулярной генетики ГУ НИИЭМ РАМН Соловьевым К. В, секвенирование ПЦРпродукта осуществлено Бабичем . . Эксперименты по изучению способности фрагментов ЦП защищать бактерии от окислительного стресса, осуществлены совместно с аспирантом СПбГУ Повалихиным Р. Г. под руководством д. Отдела молекулярной генетики ГУ НИИЭМ РАМН Н. В. Цымбаленко. Консультирование компьютерного моделирования пространственных моделей белков осуществлял к. Биофизики ГОУ СПбГПУ Скворцов А. Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы и Список цитируемой литературы, включающий 0 иностранных и отечественных источников. Диссертация изложена на 6 стр. Результаты представлены в 4 таблицах и иллюстрированы рисунками. Правительства СанктПетербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых и специалистов в области естественных наук гг. Федерального агентства но образованию .