Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора

• Автор: Глинщикова, Ольга Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Внутренние стандарты

1.1.1 Амплифюсационные методы определения вирусных нуклеиновых кислот.

1.1.2 Количественное определение нуклеиновых кислот.

1.1.3 Метод лимитирующих разведений.

1.1.4 Конкурентная ПЦР

1.1.5 i ПЦР.

1.1.6 Внутренние стандарты

1.1.7 Свободные РНК и ДНКстандарты.
1.1.8 Биологические стандарты.
1.1.9 Генноинженерные стандарты.
1.1. Армированные РНКстандарты.
1.1. Стандарты для мутационного анализа.
1.1. Скрининг продуктов крови.
1.1. Стандарты для множественных методов
1.2 Ретровирусы.
1.2.1 Структура генома и жизненный цикл ретровирусов группы V.
1.2.2 Принципы конструирования ретровирусных векторов.
1.2.3 Упаковывающие клетки
1.3 Природа вируса гепатита С.
1.3.1 Организация генома V.
1.3.2 Вариабельность генома V и его генотипы.
1.3.3 Клиническое значение генотипов V.
1.3.4 Вакцина против V.
1.3.5 Вирусная репликация
1.3.6 Репликационный цикл
1.3.7 Динамика репликации
1.3.8 Определение РНК НСV при остром и хроническом гепатите С
1.3.9 Мониторинг уровня РНК V в течение терапии
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Образцы сывороток
2.2 Определение РНК V в сыворотке крови
2.3 Выделение РНК V из сыворотки крови.
2.4 Обратная транскрипция и ПЦР
2.5 Детекция продуктов амплификации
2.6 Праймеры.
2.7 Конструирование внутреннего стандарта
2.8 Получение пакующей клеточной линии.
2.9 Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК V
2. Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК V
2. Использование внутреннего стандарта в экспериментах с
разведенными сыворотками.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Конструирование внутреннего стандарта
3.2 Получение пакующей линии клеток
3.3 Определение титра ретровирусных частиц.
3.4 Чувствительность метода
3.5 Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК V
3.6 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК V
3.7 Статистическая обработка количественных измерений
3.8 Анализ динамики вирусной концентрации на примере
разведенных сывороток.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1 Преимущества внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора.
4.2 Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера.
4.3 Полуколичественное определение
4.4 Использование внутреннего стандарта для сывороток разных генотипов.
4.5 Использование внутреннего стандарта при качественном и
количественном определении РНК НСУ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список публикаций по теме диссертации.
Список литературы


Количественное определение нуклеиновых кислот. Метод лимитирующих разведений. i ПЦР. Свободные РНК и ДНКстандарты. Биологические стандарты. Генноинженерные стандарты. Армированные РНКстандарты. Стандарты для мутационного анализа. Скрининг продуктов крови. Ретровирусы. Структура генома и жизненный цикл ретровирусов группы V. Принципы конструирования ретровирусных векторов. Природа вируса гепатита С. Организация генома V. Вариабельность генома V и его генотипы. Клиническое значение генотипов V. Вакцина против V. ГЛАВА 2. Выделение РНК V из сыворотки крови. Праймеры. Получение пакующей клеточной линии. ГЛАВА 3. Определение титра ретровирусных частиц. ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ. Преимущества внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора. Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера. Использование внутреннего стандарта для сывороток разных генотипов. Список публикаций по теме диссертации. Список литературы. ВВЕДЕНИЕ. В последние годы одним из основных методов молекулярной диагностики вирусных инфекций стала полимеразная цепная реакция. Это высокочувствительный и высокоспецифичный метод. Введение внутреннего стандарта, который амплифицируется с теми же праймерами, что и исследуемая мишень, делает реакцию амплификации конкурентной, позволяя проводить количественные оценки концентрации исследуемой мишени по известной концентрации внутреннего стандарта. Кроме того, внутренний стандарт играет роль контроля прохождения реакции в отдельной пробирке. Широкое распространение конкурентная ОТПЦР с использованием внутреннего стандарта получила при анализе экспрессии генов и при диагностике вирусных инфекций. Особые проблемы возникают при разработке РНКвнутренних стандартов. Вопервых, в отличие от ДНК молекулы РНК нестабильны, легко подвергаются рибонуклеазному расщеплению. Упаковка РНК в белковую оболочку позволяет решить эту проблему. Кроме того, упакованная РНК, в отличие от свободной, имитирует по строению исследуемый вирус, что позволяет контролировать все стадии процесса выделения РНК и ОТПЦР. Вовторых, существует проблема подсчета концентрации внутреннего стандарта. Еще не предложено внутреннего РНК стандарта, для которого эти проблемы были бы решены в полной мере, и который удовлетворял бы всем теоретическим требованиям. В связи с этим, предлагаемый в работе новый тип внутреннего РНКстандарта на основе ретровирусного вектора является весьма актуальным. Нами разработан внутренний РНКстандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С. Это рекомбинантный ретровирус, содержащий модифицированную последовательность РНК V, используемую для амплификации в ПЦР, и селективный маркер ген устойчивости к пуромицину. Наличие последнего позволяет определять титр ретровирусных частиц стандарта в экспериментах по инфицированию клеточных культур. Предлагаемый ретровирусный стандарт получают из культуры пакующих клеток, просто собирая среду культивирования, в которой росли клетки. Особое значение ПЦРдиагностика V имеег для скрининга донорской крови и ее компонентов, которые являются основными источниками вируса для лиц, получающих множественные трансфузии. Введение в диагностические тестсистемы внутреннего стандарта позволяет выявлять ложноотрицательные результаты и становится, следовательно, острой необходимостью. Кроме того, введение внутреннего стандарта дает возможность проводить количественные оценки изменения концентрации V, что представляет несомненный клинический интерес, гак как основными прогностическими факторами интерфероновой терапии являются генотип вируса и динамика изменения концентрации вируса в течение первых недель лечения. В работе продемонстрировано применение внутреннего стандарта для качественных и количественных определений РНК V. Использование рекомбинантного ретровирусного вектора это новый подход в получении внутренних стандартов для конкурентной ОТПЦР, а также для нового количественного метода определения нуклеиновых кислот i ПЦР.