Циклодекстрин глюканотрансферазы с альфа- и бета-специфичностями и сравнительный анализ их структуры

• Автор: Бикбулатова, Светлана Магнитовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 146 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Циклодекстрины и их свойства

1.1.1. Структура молекул циклодекстринов.

1.1.2. Комплексы включения циклодскстринов.

1.1.3. Применение циклодекстринов

1.2. Фермент циклодекстрин глюканотрансфсраза. Свойства

и механизм действия

1.2.1. Продуценты цнклодекс грин глюканотрансфсраз.

1.2.2. Ферментативное действие ЦТаз.

1.2.2.1. Мсжмолскулярнос трансгликозилированне
1.2.2.2. Внутримолекулярное трансгликозилированне.
1.2.2.3. Гидролиз.
1.2.3. Рентгеноструктурный анализ ЦГТаз
1.2.3.1. Доменная организация. Активные центры
1.2.3.2. Рентгеноструктурный анализ ЦГГаз в связанной форме
1.2.4. Клонирование и ссквснирование генов ЦГГаз.
Глава 2. Объект и методы исследований.
2.1. Штаммы бактерии ii ИБ7 и i . 6.6.3. .
2.1.1. Выделение и очистка ДНК ii и i . .
2.2. Получение геномных библиотек ДНК ii
и i . в фаговом векторе 3
2.3. Скрининг библиотеки генов ii и i
2.4. Определение а и рЦГТазной активности.
2.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.6. Субклонирование фрагментов ДНК, содержащих гены а и 5ЦГТаз
в векторе i II .
2.7. Высокоэффективная жидкостная хроматография циклодекстринов
2.8. Расщепление ДНК рсстриктазами.
2.9. Рестрнктазное картирование и разработка
стратегии секвенирования.
2 Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях
2 Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля.
2 Подготовка компетентных клеток.
2 Трансформация компетентных клеток .i плазмидной ДНК
2 Получение одноцепочечной ДНК.
2 Гетраокта стратегия секвенирования.
2 Секвенирование ДНК.
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов х и МДТаз и аминокислотных последовательностей кодируемых ими ферментов
2 Реактивы и материалы.
Глава 3. Результаты исследовании и их обсуждение.
3.1. Создание геномных библиотек микроорганизмов ii
ИБ7 и i . 6.6.3. и идентификация в них функциональноактивных генов, кодирующих а и рЦПазы.
3.2. Разработка стратегии секвенирования и определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК ii ИБ7 и i . 6.6.3.
3.3. Анализ нуклеотидной последовательности генов а и рЦГТаз ii ИБ7 и i . 6.6.3.
3.4. Сравнительный анализ кодирующей области генов ЦГТаз
3.5. Анализ аминокислотного состава а и ЦГТаз ii
ИБ7 и i . 6.6.3.
3.6. Анализ фланкирующих областей енов ЦГТаз
3.7. Анализ лндерных пептидов ЦГТаз
3.8. Анализ доменов ЦГТаз.
3.9. Особенности аминокислотных последовательностей а и РЦГТаз
ЗАКЛЮЧЕНИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В настоящее время имеющиеся сведения сше НС ПОЗВОЛЯЮ В связи с этим, необходимо дальнейшее изучение этих уникальных ферментов. Таким образом, клонирование и секвенирование генов ЦГТаз, а также подробный сравнительный анализ кодируемых ими белков является актуальной научной проблемой. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении структурных различии бациллярных ферментов а и i II Таз для выявления особенностей их организации и влияния последней на специфичность действия изучаемых ферментов. Создание геномных библиотек штаммов микроорганизмов ii ИБ7 и i . Идентификация в данных клонотеках функциональноактивных генов аи РЦГТаз. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК и выведение на их основе аминокислотных последовательностей а и рЦГТаз. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов ЦГТаз и аминокислотных последовательностей кодируемых ими ферментов, обладающих различной специфичностью действия, с привлечением данных по некоторым другим ЦГТазам для выявления консервативных и днвергировавших участков в молекулах ЦГТаз. Выявление особенностей эволюционирования структуры ЦГТаз и их генов у микроорганизмов, продуцирующих данные ферменты. Научная новизна и практическая значимость. Впервые клонированы фрагменты ДНК, содержащие гены а и ЦГТазы , для ЦГТазы 6, что отличает их от ранее клонированных генов ЦГТаз. Впервые выявлены различия в структуре аи ЦГТаз, выражающиеся в заменах и инсерциях отдельных аминокислот и их блоков в высококонсервативных функциональнозначимых участках молекулы ферментов. На основе гомологии аминокислотных последовательностей всех известных ЦГТаз построено филогенетическое древо, наиболее полно отражающее их родственные отношения, и приведены доказательства существования достаточно обособленных групп микроорганнзмовпродуцентов ЦГТаз. Показано, что все сравниваемые , ЦГТазы из микроорганизмов родов i, ii, vii и имеют одного общего предка и являются результатом дивергенции, тогда как происхождение ЦГТазы i i имеет независимый и в то же время конвергентный характер. Полученные нами результаты расширяют представление об организации и эволюции структуры генов циклодекстрин глюканотраисфераз, а также способствуют более полному пониманию различий в функционировании данных ферментов. Они могут быть использованы в исследованиях по конструированию ферментов ЦГТаз с заданными свойствами. А проба дня работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции биохимического общества РАН, посвященной памяти академика А. УНЦ РАН Уфа, и Международной конференции Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы Пермь, . Пуо. Основные результаты диссертации изложены в трех печатных работах, а также депонированы в международных банках данных i i , и I . Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов и методов исследования глава 2, результатов исследования и их обсуждения глава 3, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 5 названий, в том числе 2 работы иностранных авторов. Работа изложена на 6 страницах и содержит рисунков и 9 таблиц. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . Циклодекстрины были открыты УИНеге в году УННгз, . Позднее было показано, что это соединения углеводной природы, представляющие собой замкнутые в кольца остатки глюкозы БсИагсНгег, . Ранее циклодекстрины получали в результате воздействия на крахмал ферментных препаратов из культуральной жидкости некоторых бактерий. Поскольку данные ферменты не строго специфичны к сайту гидролиза, то конечный продукт представляет собой смесь различных циклодекстринов и линейных олигосахаридов разной длины. Известны три типа циклодекстринов а, ри у, состоящие из 6ти, 7ми и 8ми остатков глюкозы, соответственно рис. Рис 1.