Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител

• Автор: Вечканов, Евгений Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 154 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы. и

1.1. Бактериологические особенности Н. i

1.2. Роль белковоантигенных комплексов в патогенности Н. i.

1.3. Проблемы диагностики Н. i.

1.4. Микробиологические и серологические методы диагностики Н.

i.

1.5. Методы получения моноклональных антител и их практическое использование

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Лабораторные животные

2.2. Бактериальные штаммы и антигены

2.3. Приготовление элективной питательной среды для выделения и культивирования Н. i СЭХ и е экспериментальная оценка
2.4. Культивирование штаммов Н. i
2.5. Клеточные линии позвоночных
2.6. Оборудование и реактивы, схема этапов работы
2.7. Получение гибридом
2.7.1 Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной
сыворотки
2.7.2. Гибридизация клеток
2.7.3. Клонирование гибридом
2.7.4. Культивирование гибридом i vi и i viv
2.7.5. Криоконсервирование гибридом
2.8 Метод очистки иммуноглобулинов
2.9. Выделение и фракционирование белков Н. i. Электрофорез
белков в полиакриламидном геле
2.9.1. Подготовка и проведение электрофореза
2.9.2. Визуализация белковых фракций методом окрашивания геля i
ii 0.
2 Иммуноферментные методы
. Твердофазный иммуноферментный анализ
. Иммуноферментный анализ дотблот
. Метод непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител
. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони
. Конкурентный иммуноферментный анализ
2 Иммуноблоттинг
. Элсктропсрснос фракционированных белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану
. Визуализация белковых фракций на фильтре
. Проведение иммуноблоттинга
2 Характеристика белкового антигена методом спектрофотометрии
. Элюирование белкового антигена
. Определение концентрации белка по Лоури
. Исследование спектров поглощения и собственной флуоресценции белка препарата.
2 Денситометрический метод обработки результатов гельэлектрофореза и используемое програмное обеспечение
2 Методы статистической обработки результатов исследования
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Результаты культивирования бактериальных штаммов Н. i и иммунизации лабораторных животных
3.2. Исследование и оценка ростовых и элективных свойств среды СЭХ
для выделения и культивирования Н. i.
Характеристика полученных колоний Н. i.
3.3. Иммунизация
3.4. Получение и первичный скрининг гибридомпродуцентов МКА к белкам Н. i
3.5. Оценка специфической активности МКА в серолоических методах
3.6. Определение эпитопной направленности МКА к Н. i
3.7. Определение класса полученных иммуногобулинов
3.8. Получение препаративных количеств МКА, их очистка
3.9. Фракционирование и построение белкового профиля Н. i
3 Денситометрическое исследование белковых фракций Н. i
3 Сравнительное исследование белковых фракций Н. i методом иммуноблоттинга. юз
3 Оценка термолабильности белкового антигена Н. i, выявляемого МКА гибридомы В .
3 УФ спектры поглощения и флуоресценции белка.
3 Определение небелковых компонентов белковых фракций.
3 Оценка возможности использования полученных МКА в диагностике
Н. i инфекции.
3 Сравнительный анализ чувствительности иммунохимических
методов на основе МКА и поликлональных сывороток.
Обсуждение результатов исследования .
Выводы.
Список использованной литературы


Оценка диагностической значимости моноклональных антител в серологическом методе диагностики Н. Научная новизна. В результате проведнных исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Н. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств
микроорганизма Н. В результате проведнных исследований созданы гибридомыпродуценты моноклональных антител строго специфичных в отношении белковых антигенов микробных клеток Н. Показано отсутствие перекрстной активности моноклональных антител гибридомы В с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с Н. Впервые методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В. Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной белковой формой УФ абсорбционного спектра и спектра флуоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот. Впервые оценена возможность применения полученных моноклональных антител гибридомы В для изучения антигенной структуры штаммов Н. Н. i инфекции. В результате исследования показано, что использование среды СЭХ в практических медицинских учреждениях позволит значительно повысить эффективность исследования материала, подозрительного на обсемененность хеликобактериями. Получена коллекция гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к белковым антигенным детерминантам Н. Ростовского противочумного института. Произведено депонирование гибридомы. Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой В и белковантигенов Н. Н. i инфекции. Материалы диссертации используются при чтении общего курса Биотехнология и спецкурса молекулярная иммунология на кафедре биохимии и микроюиологии Ростовского госуниверситета. По материалам диссертации планируется создание и введение в клиниколабораторную практику тестсистемы скрининга Н. Основные положения выносимые на защиту. В результате проведнных исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Н. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Н. Охарактеризован фракционный состав белков Н. Получен набор стабильных гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам Н. Методом иммуноблоттинга идентифицирован белковый антиген, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В. Проведено выделение данного белкового антигена. Антиген термолабилен, имеет молекулярную массу 1 кДа, типичные белковые адсорбционные спектры и спектры флюоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот. Показана диагностическая значимость, полученных моноклональных антител гибридомы В. Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях биологопочвенного факультета Ростовского государственного университета РостовнаДону, , а также были представлены на 2, 3, 4 международной межвузовской конференции молодых учных Обмен веществ при адаптации и повреждении Ростовского государственного медицинского университета РостовнаДону, . Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две в центральной печати. Личный вклад автора 0. ГЛАВА 1. Бактериологические особенности Н. В году . В. описали выделенную из биоптата больного с антральным гастритом спиралевидную бактерию, названную i i. К настоящему моменту этот микроорганизм описан как грамотрицательная бактерия размерами 0,5 мкм в ширину и 2, мкм в длину, с лофотрихальным жгутикованием рис. Барановский А. Ю., Щукина О. Б., Назаренко Л. И., . Жгутиков у хеликобактера обычно от 4 до 5 но бывает и 7, часто покрыты чехликами, с утолщениями на конце. В клеточной стенке преобладают гексадекановая, октадеценовая и гексадеценовая жирные кислоты. Определение жирнокислотного состава клеточной стенки явилось систематически значимым и позволило отделить i . Коротяев А. И., Бабичев , . Культивирование . С. В аэробных и анаэробных условиях хеликобактер не растт. Рис. Строение .