Факторы, определяющие субстратную специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Escherichia coli и человека

• Автор: Сидоренко, Виктория Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 160 с. : ил.

Содержание
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Окислители и антиоксиданты
2.2. Повреждения ДНК
2.2.1. Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК
2.2.2. Продукты электрофильного присоединения
2.2.3. Апурин-апиримидиновые сайты
2.2.4. Фотопродукты
2.2.5. Окисленные пиримидиновые основания
2.2.6. Окисленные пуриновые основания
2.2.6.1. 8-оксогуанин и формамидопиримидиновое производное гуанина
2.2.6.2. 8-оксоаденин и формамидопиримидиновое производное аденина
2.3. Биологические последствия окислительных повреждений ДНК
2.4. Репарация
2.4.1. Общий механизм эксцизионной репарации оснований
2.4.2. ДНК-гликозилазы
2.4.3. Каталитический механизм ДНК-гликозилаз
2.4.4. GO-система
2.4.5. Формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg или MutM)
2.4.6. Эндонуклеаза VIII (Nei)
2.4.7. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека, OGG1
2.4.8. АП-эндонуклеазы
2.4.9. Коррелированный поиск повреждений в эксцизионной репарации
оснований
2.4.10. Белок-белковые взаимодействия в процессе эксцизионной репарации оснований
2.4.11. Полиморфные варианты гена OGG1 и риск возникновения онкологических заболеваний
2.4.11.1. Полиморфные варианты OGG1
2.4.11.2. Функциональность полиморфных вариантов OGG1
2.4.11.3. Эпидемиологические исследования ассоциации OGG1 с онкологическими и другими заболеваниями
3. Материалы и методы
3.1. Реактивы
3.2. Дезоксирибоолигонуклеотиды
3.3. Ферменты
3.4. Штаммы бактерий
3.5. Сайт-направленный мутагенез OGG1
3.6. Выделение 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека (OGG1)
3.7. Выделение АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1)
3.8. Определение концентрации белка
3.9. Г ель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов
3.10. Введение 32Р метки по 5’-концу дезоксирибоолигонуклеотидов
3.11. Стандартные условия отжига комплементарных цепей олигонуклеотидов
3.12. Определение концентрации активной формы OGG1
3.13. Влияние ионной силы и ионов Mg2+ на специфичность OGG1 и Fpg
3.14. Определение кинетических параметров Fpg и OGG1
3.15. Определение влияния OGG1 на активность АРЕХ1
3.16. Взаимодействие 0GG1 с АП-эндонуклеазами и ДНК-глшсозилазами
3.17. Моделирование каталитической схемы OGG1 по методу Монте-Карло
3.18. Препаративный синтез ковалентного комплекса OGG1 с дуплексами, содержащими 8-oxoGua
3.19. Регистрация взаимодействия комплекса ДНЮООО! с АРЕХ1, Apnlp и Nfo
3.20. Взаимодействие комплекса flPIIOOGGl cAPEXl на нитроцеллюлозных мембранах
3.21. Получение конкатемерной ДНК
3.22. Определение механизма вытеснения OGG1 АП-эндонуклеазой
3.23. Получение субстратов для экспериментов по коррелированному расщеплению
3.24. Коррелированное расщепление субстратов
3.25. Клонирование генов mtu-nei2 и mtu-fpg2 из М. tuberculosis
3.26. Комплементация генами mtu-nei2 и mtu-fpg2 мутантных фенотипов E
3.27. Экспрессия и выделение белка Mtu-Nei2
3.28. Определение активности препаратов Mtu-Nei2
3.29. Образование ковалентных комплексов Mtu-Nei2 с поврежденной ДНК.. 72 Результаты и их обсуждение
4.1. Влияние ионов Mg2+ и ионной силы на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз E. coli и человека
4.1.1. Влияние ионной силы и дивалентных катионов па активность и
специфичность OGG1 и Fpg
4.1.2. Влияние органических анионов на специфичность Fpg и OGG1
4.1.3. Отсутствие влияния полиаминов, краудинг-агентов и некоторых
аналогов пуринов на активность и специфичность OGG1 и Fpg
4.1.4. Влияние условий реакции на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-
гликозилаз: заключение
4.2. Взаимодействие OGG1 с АРЕХ1 и влияние этого взаимодействия на специфичность OGG1
4.2.1. Стимуляция активности OGG1 в присутствии АРЕХ1
4.2.2. Активность OGG1 в присутствии АРЕХ1 для субстратов с различным
положением 8-oxoGua:Cyt
4.2.3. Активность OGG1 в присутствии АП-эндонуклеаз из S. cerevisiae и

4.2.4. Влияние других ДНК-гликозилаз и АП-лиаз на активность OGG1
4.2.5. Образование тройного комплекса между OGG1, ДНК и АП-
эндонуклеазами
4.2.6. Влияние АРЕХ1 на основные кинетические параметры OGG1
4.2.7. Расщепление АП-эндонуклеазой АРЕХ1 субстрата, содержащего
аналог АП-сайта, в присутствии OGG1
4.2.8. Специфичность стимуляции OGG1 в присутствии АРЕХ1
4.3. Процессивность ДНК-гликозилаз и ее вклад в субстратную специфичность
4.3.1. Коррелированное расщепление одноцепочечных и двуцеиочечных
субстратов урацил-ДНК-гликозилазой E. coli (Ung)
4.3.2. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность
фермента Fpg
4.3.3. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность
фермента OGG1

4.3.4. Коррелированное расщепление ферментами Fpg и OGG1 субстратов, содержащих брешь
4.3.5. Коррелированное расщепление ДНК мутантными формами Fpg
4.3.6. Процессивность при вытеснении АП-эндонуклеазой фермента OGG1 из комплекса с продуктом
4.3.7. Влияние процессивности на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз: заключение
4.4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1
4.4.1. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении олигонуклеотидных субстратов
4.4.2. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении высокомолекулярной ДНК
4.4.3. Стимуляция активности мутантных форм OGG1 АП-эндонуклеазой АРЕХ1
4.4.4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1: заключение
4.5. Клонирование и характеризация гомологов Nei и Fpg из М. tuberculosis
4.5.1. Комплементация мутантого фенотипа E
4.5.2. Выделение и характеризация рекомбинантного белка Mtu-Nei2
5. Заключение
6. Выводы
7. Список литературы

в разд. 2.4.7). Причины такого расхождения между методами на сегодняшний день неизвестны.
Помимо ДНК-гликозилазной активности, фермент Fpg обладает ассоциированной АП-лиазной активностью [133], а также способен выступать в роли dRP-лиазы, отщепляя 5’-концевой остаток 2’-дезоксирибо-5’-фосфата на месте одноцепочечного разрыва ДНК [134]. В отличие от бифункциональных ДНК-гликозилаз, принадлежащих к суперсемейству Nth, Fpg эффективно катализирует как [5-, так и 5-элиминацию, оставляя на месте повреждения однонуклеотидную брешь, обрамленную фосфатными группами [82], причем, по всей вероятности, эти реакции протекают без диссоциации фермента из комплекса с субстратом, поскольку Fpg не проявляет активности по отношению к субстратам, представляющим собой продукты р-элиминации [82].
При обработке NaBH4 комплекса Fpg с субстратом происходит образование стабильного ковалентного комплекса [88, 135]. Масс-спектрометрический анализ продуктов трипсинолиза этого комплекса позволил установить, что катализ выщепления основания ферментом Fpg проходит с образованием основания Шиффа между остатком Рго-1 и атомом С1’ поврежденного dN [90]. Замена остатка Рго-1 на другие аминокислотные остатки приводит к значительной или полной инактивации Fpg в зависимости от субстрата и типа введенного аминокислотного остатка [135, 136]. Таким образом, члены семейства Fpg образуют в качестве интермедиата основание Шиффа пирролидиновой природы, несущее постоянный положительный заряд на атоме азота; возможно, именно эта особенность Fpg стимулирует его гораздо более высокую активность в реакции 8-элиминации по сравнению с другими АП-лиазами.
Помимо Рго-1, методами сайт-направленного мутагенеза в Fpg были выявлены несколько позиций, важных для активности или субстратной специфичности фермента. Замена или химическая модификация остатков Cys в мотиве цинкового пальца приводит к потере ферментом способности связывать ДНК и соответственно к потере активности [137, 138]. При систематическом исследовании роли консервативных кислотных остатков в Fpg; выяснилось, что замена остатков Glu-2 и Glu-173 остатками Gin инактивирует фермент, а остатков Glu-5 и Glu-131 — значительно снижает его ДНК-гликозилазную активность [139]. Интересно, что влияние этих замен на АП-лиазную активность фермента оказалась гораздо меньше [139]. Также разное влияние на активность фермента по отношению к различным поврежденным основаниям и к АП-сайтам оказывают замены остатков Lys-56 [140] и Lys-155 [116]; как правило, активность разных мутантных форм