Исследование процессов модификации липопротеидов низкой плотности в плазме крови человека

• Автор: Каплун, Виктор Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА Г Модифицированные липопротеиды низкой плотности плазмы

крови человека

ГЛАВА 2. Сиаловые кислоты

2.1. Свойства и распространение сиаловых кислот

2.2. Биологические функции сиаловых кислот.

ГЛАВА 3. Ферменты, участвующие в метаболизме сиаловой кислоты.

3.1. Сиалидазы.

3.2. Сиалилтрансферазы.
3.3. Транссиалидазы.
3.4. Десиалирующая активность в сыворотке крови
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследований.
4.1.олучение плазмы крови и липопротеидов
4.2. Получение сиалированных и десиалированных липопротеидов плазмы крови
4.3. Нмечение сиаловой кислоты гликоконьюгатов, ганглиозидов, липопротеидов, белков и эритроцитов.
4.4. Получение липопротеидов и белков, ковалентно связанных
с агарозой
4.5. Получение десиалированного фетуина и трансферина методом кислотного гидролиза.
4.6. Выделение транссиалидазы из липопротсиддефицитной плазмы крови методом афинной хроматографии.
4.7. Клеточная культура.
4.8. Определение дссиалирования ЛНП клетками
4.9. Модификация ЛНП в плазме крови.
4 Анализ состава липопротеидов низкой плотности.
. Определение сиаловой кислоты
. Определение нейтральных сахаров.
. Определение количества десиалированных липопротеидов
. Экстракция липидов
. Определение нейтральных липидов.
. Определение фосфолипидов
. Определение холестерина.
. Определение тиобарбитуровая кислота реактивных продуктов в ЛНП.
. Определение содержания гидроперекисей в ЛНП.
4. Определение уровня конъюгированных диенов в ЛНП.
4 Электрофоретические методы.
. Определение продуктов протеолитической деградации
. Определение среднего диаметра ЛНП
. Определение суммарного поверхностного заряда ЛНП
. Определение молекулярного веса и гомогенности препарата фермента
4 Определение активности транссиалидазы с использованием в качестве субстрата Намеченного фетуина, трансферина, липопротеидов ковалентно связанных с агарозой
4 Определение активности трапссиалидазы с использованием
в качестве субстрата ганглиозидов
4 Определение активности фанссиалидазы с использованием
в качестве субстрата биотинилированных гликоконыогатов.
4 Определение активности транссиалидазы при использовании в качестве донора сиаловой кислоты эритроцитов.
4 Определение активности фанссиалидазы при использовании эрифоцитов в качестве акцептора сиаловой кислоты.
4 Определение типа образуемой гликозидной связи
4 Определение концешрации белка
4 Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 5. Модификация ЛНП клетками
ГЛАВА 6. Модификация ЛНП в плазме крови.
6.1. Десиалирование ЛНП
6.2. Изменение липидного состава ЛНП
6.3. Изменение физических свойств ЛНП.
6.3.1. Диаметр липопротеидных частиц
6.3.2. Поверхностный заряд.
6.4. Атерогенные свойства ЛНП.
6.5. Природа десиалируюшей активности в плазме
ГЛАВА 7. Транссиалидаза плазмы крови человека
7.1. Характеристики изолированного препарата фермента
7.2. Влияние значения на транссиалидазную активность.
7.3. Влияние ионов металлов на транссиалидазную активность.
7.4. Субстратная специфичность транссиалидазы плазмы крови
7.4.1. Фетуин, трансферин, ЛНП.
7.4.2. Липопротеиды плазмы крови
7.4.3. Сфинголипиды
7.4.4. Клетки крови эритроциты.
7.4.5. Синтетические гликоконыогаты
7.5. Акцепторная специфичность транссиалидазы плазмы крови
7.5.1. Гликопротеиды плазмы крови фетуин.
7.5.2. Липопротеиды гшазмы крови
7.5.3. Акцепторные свойства клеток крови эритроциты
7.5.4. Сфинголипиды
7.5.5. Синтетическиее гликоконыогаты.
7.6. Влияние транссиалидазы на атерогенность ЛНП.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Определение тиобарбитуровая кислота реактивных продуктов в ЛНП. Определение содержания гидроперекисей в ЛНП. Определение уровня конъюгированных диенов в ЛНП. Электрофоретические методы. Определение активности транссиалидазы при использовании в качестве донора сиаловой кислоты эритроцитов. Определение активности фанссиалидазы при использовании эрифоцитов в качестве акцептора сиаловой кислоты. ГЛАВА 5. ГЛАВА 6. Модификация ЛНП в плазме крови. Изменение физических свойств ЛНП. Поверхностный заряд. Атерогенные свойства ЛНП. ГЛАВА 7. Влияние значения на транссиалидазную активность. Влияние ионов металлов на транссиалидазную активность. Фетуин, трансферин, ЛНП. Клетки крови эритроциты. Гликопротеиды плазмы крови фетуин. Синтетическиее гликоконыогаты. Влияние транссиалидазы на атерогенность ЛНП. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. ВЫВОДЫ. АпоВ аполипопротеид В. Асп аспарагин. БЛ лектин бузины. Г ал галактоза. ГалЫАц ацетил галактозамин. Глю глюкоза. ГлюЫАц ацетил глюкозамин. ЛВП липопротеиды высокой плотности. ЛНП липонротеиды низкой плотности. ЛОНГ липопротеиды очень низкой плотности. ЛПП липопротеиды промежуточной плотности. МАЛ лектин Маакии амурской. Ней5Ац СК ацетил нейраминовая кислота сиаловая кислота. ПАА полиакриламид. ТБК тиобарбитуровая кислота. ТНБС тринитробензолсульфоновая кислота. Трс треонин. ТХУ трихлоруксусная кислота. Введение. За последние годы достигнуты значительные успехи в области диагностики и лечения заболеваний, связанных с атеросклеротическими патологиями магистральных кровеносных сосудов человека. Однако, несмотря на существующий прогресс в этой области, атеросклероз попрежнему является наиболее распространенной причиной смертности и инвалидности в России и зарубежных индустриально развитых странах. Одним из наиболее ранних проявлений атеросклеротического поражения является аккумуляция липидов клетками интимы аорты человека. Многочисленными работами было продемонстрировано, что ЛНП, выделенные из крови здоровых лиц, не вызывали внутриклеточного отложения липидов . Была выдвинута гипотеза об изменении свойств липопротеидов низкой плотности в результате некой химической модификации. В
дальнейшем были получены различные i vi модифицированные ЛИП. Действительно, окисленные i . Несмотря на многочисленные неудачи, поиск i viv модифицированных ЛНП активно продолжался. В пользу версии о модификации ЛНП при атеросклерозе говорил и тот факт, что липопротеиды выделенные из крови больных атеросклерозом, в отличие от нативных ЛНП, стимулировали увеличение содержания липидов в частности холестерина, клеточную пролиферацию и синтез внеклеточного матрикса, то есть являлись атерогенными v . В дальнейшем в нашей лаборатории были обнаружены и выделены из крови человека модифицированные ЛНП, обладающие пониженным, но сравнению с нативными липогротеидами, содержанием сиаловой кислоты, названные в связи с этим десиалированными ЛНП. Десиалированные липопротеиды, в отличие от нативных, вызывали аккумуляцию липидов в частности, эфиров холестерина в клетках интимы аорты человека и макрофагах, то есть являлись атерогенными. Таким образом, нами было экспериментально доказано существование в крови человека
циркулирующих модифицированных липопротсидов низкой плотности, обладающих атерогенными свойствами. Однако, на гот момент абсолютно не были известны механизмы биологических процессов, приводящих к появлению в плазме крови человека десиалированных атерогенных липопротеидов. В связи с этим, целью данной работы явилось исследование процессов модификации липопротеидов низкой плотности плазмы крови человека. Исследование модификации ЛНП в плазме крови человека т vi. Изучение свойств этого фермента. Глава 1. Модифицированные липопротеиды низкой плотности плазмы крови человека. Была установлена достоверная обратная корреляция между содержанием сиаловой кислоты в ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов i vi v , . Более того, нативные липопротеиды здоровых лиц после десиалирования бактериальной нейраминидазой приобретали атерогенные свойства v , v , .