Исследование каталитических свойств мультигемовой нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens

• Автор: Слуцки Алвира
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

1. Реактивы, используемые в работе

2. Объект исследования и условия его культивирования

3. Выделение цитохром с нитритредуктазы методом ВЭЖХ

4. Определение субъединичного состава нитритредуктазы методом ВЭЖХ

5. Определение субъединичного состава нитритредуктазы методом малоуглового рассеяния.
6. Определение субъединичного состава нитритредуктазы методом аналитического ультрацентрифугирования.

7. Определение нитритредуктазной активности по методу Грисса

8. Определение активности нитритредуктазы методом циклической вольтамперометрии 1 1

9. Определение нитрит и гидроксиламииредуктазных активностей по окислению метилвиологена

. Определение конечного продукта реакции

. . Определение пероксидазной активности Фотовосстановление нитритредуктазы ТуМИ, сенсибилизированное флавинами и птеринами
. Спектральные исследования
. Определение молекулярной массы и субъединичного состава белков методом электрофореза
. Определения рНоптимума нитритредуктазной и пероксидазной реакций
. Массспектрометрический анализ
Результаты
1. Выделение, очистка и характеристика нитритредуктазы из клеток галоалкалофильной бактерии Ти.пгагсисепз. I
2. Исследование олигомерного состава нитритредуктазы
3. Спектральные свойства ТуИР
4. Характеристика субстратной специфичности ТуМИ Зависимость активности нитритредуктазы от среды
6. 7. Определение кинетических параметров реакций, катализируемых ТуМИ Влияние различных ионов на активность ТуЬШ
8. Изучение термостабильности и температурного оптимума нитритредуктазой реакции
9. Электрохимическое исследование кинетических параметров ТуГЖ
. Определение пероксидазной активности ТуМИ
. Фотовосстановление ТуНИ, сенсибилизированное флавинами и птеринами 1
Выводы
Список публикаций Список литературы 0
Список сокращений.
ТуМ Цитохром с нитритредуктаза Шоа1ка1мЬпо иНгайгесксепв
ЧгА МВ цитохром с нитритредуктаза 1 Метилвиологен
АБТС 2,2азинобис3этилбензтиазолин6сульфокислота диаммонийная соль
НАДН Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАДФН Никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ФАД Флавинадениндинуклеотид
МаЭДТА Этилендиаминтетраацетат натрия
Рбфл Рибофлавин
РбфлН2 Рибофлавин восстановленный
ЫЕйА 1 нафтилэтилендиамин дигидрохлорид
АТФ Аденозинтрифосфат
ФМН Флавинмононуклеотид
ФМНН2 Флавинмононуклеотид восстановленный
ДТ Дитионит натрия
дек Дифференциальная сканирующая калориметрия
дмп 6,7диметилптерин
дмпн4 5,6,7,8тетрагидро6,7Диметилптерин
Км Константа МихаэлисаМентен
Введение


Исследование модельных систем транспорта электрона в активный центр нитритредуктазы фото и электрохимические системы восстановления активного центра фермента. Научная новизна. Предложена двухстадийная схема выделения vi, позволившая значительно повысить выход белка по сравнению с ранее применявшимся методом препаративного электрофореза. Охарактеризован олигомерный состав vi в растворе с применением хроматографических методов и метода малоуглового рентгеновского рассеяния. Показано, что в растворе фермент существует в виде высокостабильного гексамера с молекулярной массой около 0 кДа. Охарактеризованы физикохимические и каталитические свойства vi. Показано, что фермент катализирует реакции восстановления нитрита, гидроксиламина, сульфита и пероксида водорода. Исследовано функционирование электрон транспортной цели vi в условиях ее обеспечения электронами, поступающими от фотокаталитической системы, использующей доноры электронов флавиновой или птериновой природы или непосредственно от электрода, на который был иммобилизован фермент. Показано, что флавины иили флавосодержащие белки могут рассматриваться как потенциальные физиологические доноры электронов для vi. Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы расширяют имеющиеся сведения о свойствах мультигемовых цитохромов, играющих ключевую роль в метаболических процессах, связанных с переносом электронов. Высокая стабильность иммобилизованных на электроде препаратов vi в сочетании с широким рабочим интервалом , ионной силы, температуры, а также высокой активностью определяет перспективность использования фермента в качестве биосенсора при определении нитрита. Апробация работы. Москва, , и ii Москва, , международный конгресс Биотехнология состояние и перспективы развития Москва, , й международный конгресс i i, Vi, . Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликованы 3 статьи. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 9 ссылок. Работа изложена на 6 страницах, содержит рисунка и таблиц. Азот входит в состав основных биомакромолекул белков и нуклеиновых кислот и является одним из важнейших элементов жизни на земле. Он существует в биосфере в различных степенях окисления от Ы,до 3, превращение которых обуславливают глобальный биохимический цикл азота, включающий процессы восстановления нитрата, нитрита, окиси и закиси азота, и окисления аммиака и гидроксиламина. Превращение неорганического азота в биологически полезную форму осуществляется в процессах азотфиксации и ассимиляции азота, которые обеспечивают включение азота в углеродный скелет. Азот поглощается из окружающей среды посредством нитрификации окислительной конверсии аммония в нитрат и денитрификации последовательного восстановления нитрата до нитрита, окислов азота и и неорганического азота в процессе дыхания Рис. Первичным процессом денитрификации является процесс восстановления нитрата до нитрита, который катализируется молибденсодержащими нитратредуктазами i, . Дальнейшее восстановление образовавшегося нитрита у бактерий осуществляется в ходе процессов респираторной денитрификации последовательное восстановление нитрита через окись и закись азота до молекулярного азота или респираторной аммонификации восстановление нитрита до аммония схема 1. Эти процессы протекают в анаэробных условиях. Схема 1. Возможные пути денитрификации нитрата и нитрита у бактерий. Респираторное восстановление нитрита сопровождается образованием на мембране электрохимического протонного потенциала Ар, создание которого является необходимым условием АТФфосфорилирования и катализируется АТФсинтазой. В респираторной денитрификации могут участвовать цитохром i нитритредуктаза и медьсодержащая нитритредуктаза. Респираторная аммонификация осуществляется посредством цитохром с нитритредуктазы, при этом конечным продуктом восстановления нитрита является аммиак.