Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток

• Автор: Данилевский, Михаил Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Содержание.

Список сокращений. Стр.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Основные свойства белков теплового шока.

1.1.1. Открытие иммуногенных свойств комплексов

с пептидами.

1.1.2. БТШ. Классификация и функции.

1.1.3. Особенности генов, полиморфизм, строение

и локализация БТШ.

1.2. Рецепторы .

1.2.1. i рецепторы.
1.2.2. Рецептор .
1.2.3. Эндоцитирующие рецепторы и
v.
1.3. Возможные клеткимишени для .
1.3.1. Влияние на дендритные клетки.
1.3.2. Влияние на естественные киллеры клетки.
Глава 2. Материалы и методы.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Характеристика чистоты и иммунохимических
свойств препарата .
3.2. Исследование влияния на свойства
и функции ДК.
3.2.1. Характеристика ДК.
3.2.2. Исследование способности связываться и эндоцитироваться ДК разной
степени зрелости.
3.2.3. Исследование влияния гЬНрЛ1В на созревание ДК.
3.2.4. Изучение влияния белка гЫр на уровень секреции ФНОа дендритными клетками человека.
3.2.5. Изучение влияния гЬр на антигенпрсдставляющую способность ДК.
3.2.6. Изучение влияния белка гЫ1зр на способность дендритных клеток человека стимулировать неспецифическую спонтанную ЦТА лимфоцитов.
3.3. Изучение влияния белка гЫНр на активность естественных киллеров.
3.4. Исследование влияния АДФ на функции ДК.
3.4.1. Исследование влияния АДФ на способность ДК эндоци гировать ФИТЦмеченный пептид.
3.4.2. Исследование способности зрелых ДК, обработанных вирусосиецифическим пептидом или лизатами опухолевых клеток в присутствии АДФ, индуцировать продукцию ФНОа и ИФу лимфоцитами.
3.4.3. Исследование влияния АДФ, добавляемого при нагрузке ДК пептидными антигенами и антигенами из лизатов опухолевых клеток, на способность ДК активировать нсспецифичсскую и индуцировать антигенспецифическую ЦТА лимфоцитов.
3.5. Изучение эффективности индукции антигенспецифических ЦТЛ при использовании комплексов гЬНзр с антигенами для оптимизации введения антигенов в дендритные клетки человека
3.5.1. Изучение влияния обработки дендритных клеток человека свободным меланомаспецифическим
пептидом Ме1апЛМаП и его комплексами с гШзр на цитотоксическую активность индуцированных ими ЦТЛ в зависимости от
степени зрелости дендритных клеток
3.5.2. Изучение влияния обработки дендритных клеток человека комплексами гЬНвр с пептидами лизата опухолевых клеток на цитотоксическую активность индуцированных ими ЦТЛ в зависимости от
степени зрелости дендритных клеток.
3.5.3. Анализ уровня секреции цитокинов ИФу и ФНОа лимфоцитами после их стимуляции ДК, обработанными комплексами гШ8р с антигенами лизатов опухолевых клеток.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Анализ уровня секреции цитокинов ИФу и ФНОа лимфоцитами после их стимуляции ДК, обработанными комплексами гШ8р с антигенами лизатов опухолевых клеток. Заключение. Выводы. Список литературы. Введение. Актуальность проблемы. Многие формы онкологических заболеваний до сих пор трудно поддаются современным методам терапии, основанным на хирургическом вмешательстве, использовании химиотерапии и лучевой терапии. Поэтому наряду с совершенствованием классических методов крайне актуальными являются исследования, направленные на создание новых стратегий борьбы с раком с помощью иммунотерапии, целью которых является как предупреждение развития опухолей, так и их элиминация, в частности, с использованием белков теплового шока БТШ, Мэр для специфической активации иммунной системы. В х годах в экспериментах Р. К 5пуаз1аа и соавторов была обнаружена способность выделенных из опухолевых тканей БТШ разных семейств Нзр, йр, Нэр индуцировать клеточный противоопухолевый иммунный ответ 1,2. Иммуногенность таких препаратов определяется присутствием в их составе опухолеспецифических антигенов ОСА или их фрагментов опухолеспецифических пептидов ОСП в виде прочно связанных комплексов с БТШ 1,. Это открытие стимулировало исследования, направленные на создание реконструированных противоопухолевых вакцин па основе рекомбинантных белков НБр и р в виде комплексов с ОСА, в том числе с синтетическими МНСрестриктированными ОСП, или в виде фьюженбелков БТШ с ОСА, или в виде ДНКвакцин, содержащих гены БТШ и ОСА . Высокая иммуногенность комплексов ОСА с нативными и рекомбинантными НБр и йр обусловлена способностью этих БТШ транспортировать ОСА в важнейшие антигенпредставляющие клетки организма в дендритные клетки ДК ,. Тлимфоцитам и распознаваться Тклеточным рецептором СЭ4 и СЭ8 цитотоксических лимфоцитов ЦТЛ соответственно. Полагают, что БТШ оптимизируют этот процесс, обеспечивая транспорт ОСП через внутриклеточные мембраны в те везикулы клетки, где происходит формирование комплексов пептидов с белками МНС I. Кроме того, показано, что многие БТШ обладают иммунорегуляторной активностью и стимулируют созревание незрелых ДК и секрецию ДК цитокинов ИЛ1, ИЛ6, ФНОа и ИЛ, которые обеспечивают и поддерживают индукцию и пролиферацию антигенспецифических, в том числе, опухолеспецифических ЦТЛ . Однако, сведения об иммунорегуляторной активности БТШ весьма противоречивы. Важно отметить, что при исследовании даже высоко очищенных от эндотоксинов нативных и рекомбинантных эукариотических БТШ одни авторы обнаруживают у 1гЬр способность ускорять созревание ДК и активировать их функции , в то время как другие не находят у этого белка свойств цитокина и показывают, что его способность усиливать презентацию антигенов целиком определяется влиянием Нзр на внутриклеточную доставку пептидов при использовании антигенов в виде комплексов с Нзр ,. Разногласия в оценке иммунорегуляторной активности БТШ могут зависеть как от особенностей использованных препаратов Няр, так и от выбранных клеточных моделей. В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение влияния рекомбинантного белка НрА1В человека г1Нзр на активность ДК человека разной стадии созревания и возможности оптимизации противоопухолевого клеточного иммунного ответа при использовании реконструированных комплексов Изр с ОСА. Выделение и очистка из бактериальной массы штамма клеток . Характеристика полученного белка по молекулярной массе и иммунохимической активности с помощью электрофореза в ПААГе и иммуноблоттинга. Исследование влияния на активность клеток, уровень секреции ФНОа незрелыми ДК нзДК и зрелыми ДК зрДК и способность ДК разной степени зрелости стимулировать пролиферацию и цитотоксическую активность ЦТА лимфоцитов. ЦТЛ при использовании комплексов ОСГ1 с . ЦТЛ при использовании комплексов ОСА лизатов опухолевых клеток с . Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что выделенный и очищенный из штаммапродуцента . М. i, несмотря на высокую степень гомологии этих белков. Впервые обнаружено, что II стимулирует секрецию ФНОа и повышает способность дендритных клеток стимулировать спонтанную ЦТА лимфоцитов только при действии на зрелые дендритные клетки.