Узнавание ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека

• Автор: Василенко, Наталья Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 119 с.

Содержание
Список принятых сокращений
Введение
I. Обзор литературы
1.1. Механизмы репарации ДНК
1.1.2. Прямая репарация
1.1.2. Пострепликативная темновая репарация
1.1.3. Эксцизионная репарация
1.1.3.1. Эксцизионная репарация оснований
1.2. Общая характеристика ДНК К-гликозилаз
1.2.1. ДНК-гликозилазы, обладающие АП-нуклеазной активностью
1.2.1.1. Эндонуклеаза III Е.соН
1.2.1.2. Тимингликоль-ДНК-гликозилаза
1.2.1.3. Формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза
1.2.1.4. Гликозилаза пиримидиновых димеров
1.2.1.5. Гликозилазы неправильно спаренных оснований
1.2.2. ДНК-гликозилазы, не обладающие АП-нуклеазной активностью
1.2.2.1. Гипоксантин-ДНК-гликозилаза
1.2.2.2. 3-метиладенин-ДНК-гликозилаза
1.2.2.3. 7-метилгуанин-ДНК-гликозилаза
1.2.2.4. 0-2-метилтимин-ДНК-гликозилаза
1.2.2.5. Оксиметилурацил-ДНК-гликозилаза
1.2.2.6. Оксиметилцитозин-ДНК-гликозилаза
1.2.2.7. Гликозилаза, исключающая из ДНК остатки мочевины
1.3. Урацил-ДНК-гликозилаза
1.3.1. Накопление урацила в ДНК
1.3.1.1. Спонтанное и химическое дезаминирование цитозина
1.3.1.2. Образование урацила из аналогов азотистых оснований
1.3.1.3. Ферментативное дезаминирование цитозина
1.3.1.4. Ошибочный синтез ДНК
1.3.2. Физические свойстваУДГ

1.3.3. Аминокислотный состав и вторичная структура
1.3.4. Клеточная локализация и формы фермента
1.3.5. Регуляция активности в ходе клеточного цикла
1.3.6. Структура гена УДГ
1.3.7. Субстратная специфичность
1.3.8. Специфичность действия УДГ
1.3.9. Механизмы катализа
1.3.9.1. Механизм катализа для УДГ из HS V
1.3.9.2. Механизм катализа для человеческой УДГ
1.3.9.2.1. Роль His-268 в катализе реакции
1.3.9.2.2. Роль Asp-145 в катализе реакции
1.3.9.3. Механизмы катализа для УДГ из E.coli
1.3.10. Специфический ингибитор УДГ из бактериофага Bacillus 44 subtiles pBs2
1.3.11. Создание мутантов с новыми субстратными свойствами
II. Экспериментальная часть
2.1. Реактивы и материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Олигонуклеотиды
2.1.3. Ферменты
2.2. Методы
2.2.1. Очистка олигонуклеотидов
2.2.2. Определение коэффициента молярного поглощения для 51 олигонуклеотидов ряда d(pU)n
2.2.3. Получение ДНК-сефарозы
2.2.4. Выделение УДГ из плаценты человека
2.2.5. Препаративный синтез [3Н]би-ДНК
2.2.6. Условия проведения реакции, катализируемой УДГ
2.2.7. Определение кинетических параметров реакции гидролиза 54 N-гликозидной связи
2.2.8. Введение [32Р]-метки по 5’-положению олигонуклеотида
2.2.9. Анализ продуктов гидролиза олигонуклеотидов
III. Результаты и обсуждение

3.1. Разработка метода тестирования УДГ
3.2. Определение типа ингибирования
3.3. Минимальный лиганд активного центра
3.4. Взаимодействие УДГ с одноцепочечными дезокси - и 68 рибоолигонуклеотидами
3.5. Взаимодействие УДГ с ДНК-дуплексами
3.6. Взаимодействие УДГ с РНК-дуплексами
3.7. Г идрофобные и/или ван-дер-ваальсовы взаимодействия
3.8. Электростатические взаимодействия и вклад сахарофосфатного 78 остова в оразование контактов между субстратом и УДГ
3.9. Совокупность слабых взаимодействий
ЗЛО. Расположение активного центра УДГ
3.11. Вклад Ли в сродство к ферменту
3.12. Специфичность действия УДГ
3.13. Факторы отбора субстратов
ІУ. Выводы
Список литературы

смысл, так как U:G пара при следующем цикле репликации, если не будет исправлена, может привести к транзиции, в то время как U:A пара мутацией не является и может лишь препятствовать специфическому связыванию белков. Однако существует ряд исключений, и в некоторых последовательностях урацил удаляется быстрее из U:A пар, чем из U:G [177, 180, 181].
Показано, что в составе ДНК нуклеотидное окружение модифицированного звена влияет на эффективность выщепления. Так, урацил выщепляется из 5’-АУТ АУТ UA АУТ АУТ-3’ примерно в 10 раз лучше, чем из 5’-G/C G/C U G/C G/C-3’ и 5’-G/C G/C U TG/C G/C-3’ последовательностей [177, 180, 181]. Эти данные свидетельствуют о том, что плавление двойной спирали ДНК является важным фактором в процессе удаления урацила. В случае одноцепочечных олигонуклеотидов такая зависимость отсутствует.
Исследования выживаемости фага М13 показали, что репарация остатков урацила, расположенных в одной цепи, независимо от их числа, происходит легче, чем репарация 2 урацилов, расположенных на противоположных цепях вблизи друг от друга [182].
Обработка ДНК, содержащей значительные количества остатков урацила (ДНК фага PBS 2, гголи(<ШДС)), УДГ не дает 100% выщепления урацила. Вероятно, близко расположенные соседние урацилы, АП-сайты, образующиеся в ходе реакции, снижают ферментативную активность неизвестным образом. Показано, что УДГ из тимуса теленка ингибируется АП-сайтами [182]. С помощью РСА и кинетических исследований подтверждено, что УДГ из организма человека связывает АП-сайты лучше и быстрее, чем dU-ДНК [183].
Согласно Kumar N.V. с соавт. [184], удаление остатков урацила из петлевых структур ДНК очень затруднено. Сравнение кинетических параметров, характеризующих удаление урацила из дуплексов и петлевых структур, показало, что в последнем случае происходит 5-кратное повышение величины Км с одновременным 3 - 4-х кратным понижением значения Vmax. При добавлении в реакционную смесь белков, связывающих оцДНК (SSB - белки или белки Альбертса) происходит 7 - 140 - кратное увеличение эффективности удаления урацила из петлевых структур за счет улучшения связывания субстрата и увеличения скорости реакции. Напротив, добавление SSB-белков в реакционную смесь, содержащую в качестве субстрата оцДНК приводит к 2 - 3-кратному