Исследование механизмов индукции цитохрома Р450 подсемейства 2В в печени экспериментальных животных

• Автор: Пустыльняк, Владимир Олегович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Введение

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Цитохром Р0 ключевой фермент микросомальной монооксигеназной системы.

1.1.1 Способность цитохромов Р0 к индукции.

1.2 Цитохромы Р0 подсемейства 2В

1.3 Индукция генов 2 под действием фенобарбитала

1.3.1 Механизм активации генов 2 под действием фенобарбитала

1.3.2 Характеристика дистального промотора генов 2

1.3.3 и другие белки, взаимодействующие с элементами дистального промотора генов СУР2В.

1.3.4 рецепторопосрсдованная сигнальная трансдукцня и индукция

генов 2.
1.3.5 Участие коактиваторов в опосредованной активации экспрессии генов
2.
1.3.6 Характеристика проксимального промотора генов 2.
ф 1.3.7 Белок, взаимодействующий с проксимальным промотором генов 2 и
6 i i
1.3.8 Белки, взаимодействующие с проксимальным промотором генов 2 млекопитающих.
1.3.9 Вклад проксимального и дистального промоторов в общий механизм индукции
генов 2.
1.3. Другие регуляторные элементы генов 2.
1.4 Индукция активности С2 под действием индукторов ФБтипа.
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы.
2.2 Методы
2.2.1 Животные
2.2.2 Выделение микросом печени животных
ф 2.2.3 Определение концентрации белка в микросомах
2.2.4 Определение общего содержания цитохрома Р0 в микросомах печени
2.2.5 Определение каталитической активности 2.
2.2.6 Определение каталитической активности 3.
2.2.7 Метаболизм тестостерона
2.2.8 Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях
2.2.9 Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану
2.2. Иммунохимический анализ белков микросом
2.2. Выделение суммарной клеточной РНК
2.2. Электрофорез РНК в частично денатурирующих условиях
2.2. Определение концентрации РНК в образце.
2.2. Реакция обратной транскрипции
Ф 2.2. Мультиплексная полимеразная цепная реакция ПЦР
2.2. Анализ продуктов ПЦР.
2.2. Выделение ядер из печени крыс
2.2. Выделение белковых экстрактов ядер.
2.2. Определение количества белка в белковых экстрактах ядер.
2.2. Включение метки в 5концы ДНК с помощью полинуклеотидкиназы
бактериофага Т4
2.2. Метод задержки ДНКбелковых комплексов в геле
2.2. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1 Межвидовые особенности индукции активности СУР2В
3.1.1 Межвидовые различия в индукции микросомальной монооксигеназной системы в печени крыс и кроликов под действием 2,4,6 трифенилдиоксана1,3
3.1.2 Экспрессия генов СУР2В в печени крыс и мышей под действием индукторов фенобарбиталового типа
3.1.3 Исследование влияния индукторов на образование комплексов ядерных белков с
регуляторным элементом ЫЯ1 РВЕМ.
3.2 Исследование роли последовательности Барбибокс в индукции экспрессии генов
СУР2 В.
3.2.1 Динамика образования ДНКбелковых комплексов с последовательностью Барбибокс в печени крыс при индукции 2,4,6трифенилдиоксаном1,3 и
фенобарбиталом
3.2.2 Экспрессия генов СУР2В в печени крыс в зависимости от времени действия 2,4,6трифенилдиоксана1,3 и фенобарбитала
3.3 Влияние ингибиторов БегТЪг протеинкиназ и протеинфосфатаз на индукцию Ф активности СУР2В 2,4,6трифенилдиоксаном1,3 и фенобарбиталом в печени крыс
3.3.1 Ферментативная активность СУР2В в печени крыс.
3.3.2 Иммуноблотанализ микросомальных белков СУР2В.
3.3.3 Анализ экспрессии генов СУР2В в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов
3.3.4 Анализ экспрессии гена рецептора САЛ в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов
ф 3.3.5 Исследование образования комплексов ядерных белков с регуляторным
элементом 1 генов СУР2В
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Заключение
Выводы
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
арил гидрокарбоновый рецептор
i ингибитор протеинкиназы С iiii I
конститутивный андростановый рецептор
цитохром Р
диоксинчувствительные элементы
глицеральдегид3фосфат дегидрогеназа
глюкокортикоидчувствитсльный элемент
2 клетки гепатомы человека
белок теплового шока
негативный элемент
1 сайт связывания ядерного фактора
1 и 2 сайты связывания ядерных белков в дистальном промоторе фенобарбиталчувствительный энхансерный модуль фенилметилсульфонилфторид X ретиноидный X рецептор додецилсульфат натрия
ингибитор фосфатидилинозитол3 киназы i
7 ингибитор Са2кальмодулинзависимой киназы II
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДМСО диметилсульфоксид
НАДФ никотииамиддинуклеотидфосфат
ОА окадаевая кислота
ОТ обратная транскрипция
п.н. пара нуклеотидов
ПАУ полициклические ароматические углеводороды ПРОД пентоксирезоруфинОдеалкилазная активность ПЦР полимеразная ценная реакция РЕ позитивный элемент т.п тысяча пар нуклеотидов
1,4бис,5дихлоропиридилоксибензол
ТФД 2,4,6трифенилдиоксан1,
ФБ фенобарбитал
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ВВЕДЕНИЕ


Однако знания, касающиеся механизмов индукции, ограничены несколькими членами суперсемейства цитохрома Р0, хотя транскрипционный механизм активации показан для большинства подсемейств i, . Известно, что гены этих ферментов активируются с участием различных ядерных рецепторов, которые под действием ксенобиотикалиганда, как правило, либо транслоцируются из цитоплазмы в ядро, либо активируются в ядре, где они, образуя гстеродимеры со своими ядерными партнерами, взаимодействуют с генамимишенями i, , . Среди множества форм этого фермента выделяют подсемейство 2, которое участвует в биотрансформации лекарств, таких как циклофосфамиды . В1 и специфичных для табака нитрозоаминов . Известно, что регуляция транскрипции осуществляется за счет взаимодействия специфичных ядерных белков с различными регуляторными зонами генов 2. В составе регуляторных последовательностей генов 2 были идентифицированы так называемые проксимальный и дистальный промоторы, участвующие в индукции экспрессии этих генов под действием фенобарбитала ФБ, классического индуктора этого подсемейства , . Значительный прогресс в понимании механизмов активации генов 2 был достигнут с идентификацией конститутивного андростанового рецептора . Так, при исследовании механизма индукции активности 2 фенобарбиталом было показано, что в цитоплазме гепатоцитов происходит активация рецептора , после чего он транслоцируется в ядро, где связывается с ядерным белком X ретиноидный X рецептор. Сформировавшийся гетеродимерный комплекс взаимодействует с элементом дистального промотора, что является необходимым для инициации транскрипции i . Такой механизм индукции экспрессии генов 2 фенобарбиталом является на сегодняшний день общепринятым. Однако, несмотря на интенсивные исследования, детально механизм, по которому индукторы инициируют транслокацию в ядро, на сегодняшний день до конца не ясен, хотя показано, что прямое связывание рецептора с лигандом не является необходимым для транслокации рецептора в ядро . Было выдвинуто предположение, что транслокация рецептора в ядро контролируется запуском процессов фосфорилирования дсфосфорилирования белков, но единой картины о роли этих процессов пока не сложилось , i, . Наряду с этим, в литературе есть данные о вовлечении в механизм индукции проксимального промотора через активацию не идентифицированных пока ядерных белков i, ii, . В лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза ИМББ СО РАМН г. ТФД. Преимущество этого соединения состоит в том, что его эффективная доза на порядок меньше, чем у фенобарбитала. В экспериментах i vi было показано, что 2,4,6трифенилдиоксан1,3 и фенобарбитал активируют разные ядериые белки, способные взаимодействовать с последовательностью Барбибокс проксимального промотора iiv . Однако значение и взаимное влияние различных ядерных белков, активирующихся под действием индукторов ФБтипа i viv, на данный момент не известны. Кроме того, эффект ТФД видоспецифичен он активирует 2 у крыс, но не у мышей Мишин и др. Причина видоспецифичных различий в индукции активности этого цитохрома Р0 остается неизвестной. Изложенное выше определило цель работы исследовать молекулярные механизмы индукции 2 в печени экспериментальных животных, обработанных индукторами фенобарбиталового типа. Изучить индуцирующее действие ТФД на монооксигсназную систему печени крыс и кроликов. Исследовать образование комплексов ядерных белков с элементом 1 регуляторной последовательности гена 2 в печени крыс и мышей при индукции ФБ, ТФД и ТСРОВОР. Исследовать динамику образования комплексов ядерных белков с последовательностью Барбибокс проксимального промотора и относительное содержание мРНК 2 в печени крыс при индукции 2,4,6трифснилдиоксаном1,3 и фенобарбиталом i viv мин, Зч, 6ч, ч. Исследовать влияние ингибиторов протсинкиназ и протеинфосфатаз на ферментативную активность и содержание белков 2 в печени крыс при индукции 2,4,6трифснилдиоксаном1,3 и фенобарбиталом. Определить относительное содержание мРНК 2, и исследовать образование комплексов ядерных белков с элементом 1 регуляторной последовательности в печени крыс при совместном и раздельном введении ингибиторов и индукторов.