Изучение роли первичной структуры щелочной фосфатазы и ее секреция через цитоплазматическую мембрану Escherichia coli

• Автор: Золов, Сергей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 109 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные принципы организации секреторного

аппарата ii i.

1.1.1. Цитоплазматические факторы секреции

1.1.2. Белок транслокационная АТФаза

1.1.3. Мембранная часть транслокационного аппарата

1.1.4. Сигнальные пептидазы.

1.1.5. Фосфолипиды как интегральная часть секреторного

аппарата.
1.1.6. Катчитический цикл транслоказы белковпредшественников.
1.2. Особенности первичной структуры секретируемых белков.
1.2.1. Роль первичной структуры сигнального пептида.
1.2.2. область сигнального пептида .
1.2.3. Собласть сигнального пептида
1.2.3. Особенности структуры зрелой части
экспортируемых белков
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды
2.2. Среды и условия культивирования
2.3. Ферменты и реактивы
2.4. Методы работы с ДНК
2.5. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез
2.6. Полимеразная цепная реакция
2.7. Определение скорости превращения предшественника
щелочной фосфатазы в зрелую форму i viv.
2.8. Субклеточное фракционирование и выделение щелочной фосфатазы
2.9. Изучение кинетических параметров щелочных фосфатаз.
2 Аналитические методы.
2 Статистический анализ
2 Молекулярное моделирование.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение мутантных форм щелочной фосфатазы . i и
генетическая оптимизация условий их экспрессии и секреции.
3.1.1. Введение направленных мутаций в ген щелочной
фосфатаз . i.
3.1.2. Клонированние генов щелочной фосфатазы . i под
контроль арабинозного промотора.
3.2. Изучение зависимости секреции от заряда концевой области сигнального пептида и его взаимодействия с
анионными фосфолипидами мембраны
3.3. Изучение влияния первичной структуры Сконцевой области сигнального пептида на эффективность процессинга предшественника щелочной фосфатазы сигнальной пептидазой
3.3.1. Статистический анализ сайта процессинга известных секреторных белков грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов
3.3.2. Изучение созревания мутантных щелочных фосфатаз с заменами аминокислот в Сконцевом домене
сигнального пептида
3.4. Обнаружение экспортинициирующсго домена в концевой области зрелой полипептидной цепи щелочной фосфатазы
Е. со И и изучение его роли в секреции
3.4.1. Статистический анализ распределения заряда в концевой области зрелых полипептидных цепей секретируемых белков
3.4.2. Анализ секреции мутантных щелочных фосфатаз . i.
3.4.3. Замены аминокислот в концевой области зрелой поли пептидной цепи щелочной фосфатазы влияют на
секрецию фермента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА


Состояние проблемы. Биогенез и секреция белков являются актуальными проблемами современной биохимии. Несмотря на значительные успехи в понимании молекулярных основ этих процессов, механизм переноса гидрофильных молекул секретируемых белков через гидрофобный липидный бислой мембран остается еще во многом неясным. Согласно имеющимся в настоящее время данным и представлениям транслокация белка через мембрану определяется прежде всего структурой самого белка и его специфических доменов , , i, I, i, . Большинство секретируемых белков синтезируется в виде предшественников, содержащих на конце сигнальный пептид СП. Он необходим для транслокации белка через мембрану v i, , , i, i, I, и отщепляется после завершения транслокации сигнальной пептидазой. Сконцевую область. Потребность в сигнальном пептиде для узнавания белком секреторного аппарата клетки и в инициации секреции к настоящему времени можно считать доказанной. Однако вопрос о конкретной роли других доменов СП, а также зрелой части белка в секреции остается до конца не решенным. концевая область СП и наличие в этой области положительно заряженных остатков является важным для транслокации ряда белков v . I . i, i . , ii, i . . Однако функция положительно заряженных остатков остается не ясной. Предполагается, что они взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран, что подтверждено i vi, но вопрос о характере такого взаимодействия i viv остается до сих пор открытым. Сконцевая область сигнального пептида интересна изза ее вовлечения в специфическое взаимодействие с сигнальной пептидазой, осуществляющей процессинг. Структура этой области подчиняется правилу 3 1 в этих положениях встречаются только небольшие и незаряженные аминокислотные остатки v i, . Изучение мутантных секретируемых белков с единичными аминокислотными заменами в этих положениях подтвердило их важность для процессинга созревании белка. Подробное изучение влияния аминокислотных замен в Сконцевой области сигнального пептида на процессинг ранее было проведено только на мальтозосвязывающем белке МВР и белке оболочки фага М i . . . Несмотря на то, что в целом правило 3 Г было подтверждено, экспериментально детальный анализ процессинга был существенно затруднен наличием альтернативного сайта отщепления сигнального пептида. , находящийся на границе гидрофобного и Сконцевого доменов. Детальный анализ области 51 на примере , проведенный ранее в нашей лаборатории, также показал важность аминокислотных остатков не только в пложениях 3 1, но и в 5 положении v i, . Однако, роль 5 положения в формировании сайта процессинга, наиболее компетентного для узнавания сигнальной пептидазой, была не определена. Согласно теории белкового топогенеза Г. Блобла , информация о секреции заключена не только в СП но и в топогенных последовательностях зрелого белка. Изучение секреции гибридных белков действительно показало, что наличие сигнального пептида не всегда обеспечивает эффективную секрецию. Попытки индуцировать секрецию гибридных белков, содержащих сигнальные последовательности секретируемых и полипептидные цепи цитоплазматических белков, часто были неудачными i, , i . . . v . Это подтверждаег наличие экспортного сигнала не только в сигнальном пептиде предшественника, но и в концевой области зрелой полипептидной цепи секретируемого белка. При изучении мутантного мембранного белка, лидерной пептидазы, было показано, что для эффективной транслокации такого белка важна последовательность первых аминокислотных остатков концевого домена , v i, . Однако точный размер и свойства экспортного сигнала в зрелой полипептидной цепи не установлены.