Исследование хитинолитического комплекса бактериального штамма Vibrio sp. X

• Автор: Бабенко, Алексей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 149 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление.

Список сокращений.

Введение

Г лава 1. Обзор литературы

1.1. Хитин

1.1.1. Распространение хитина в природе.

1.1.2. Химическая природа и физнко химические свойства хитина

1.1.3. Получение хитина из природных источников.

1.1.4. Биосинтез хитина.

1.1.5. Биологическая активность хитина и его соединений

1.2. Хитиназы.
1.2.1. Первые этапы изучения бактериальных хитиназ
1.2.2. Общие свойства хитиназ.
1.2.3. Распространение хнтииаз в природе
1.2.4. Выделение хитиназ
1.2.5. Измерение активности хитиназ.
1.2.6. Строение и классификация хитиназ.
1.2.7. Происхождение, классификация и строение растительных хитиназ
1.2.8. Происхождение, классификация и строение бактериальных хитиназ.
1.2.9. Строение и каталитическая активность хитиназ.
1.2 Регуляция активности генов хитиназ
1.2 Хнтиназы микроорганизмов рода Vii.
1.2 Ингибиторы хнтиназ.
1.2 РМацетилглюкозаминидазы хитобиазы и их свойства.
1.2 Деацетил азы и их свойства.
1.3. Применение хитина и хитиназ.
1.4. Краткая характеристика бактериального рода Vii.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Среды и реактивы
2.2. Бактериальные штаммы.
2.3. Определение концентрации сахаров
2.4. Приготовление субстратов для ферментативных исследований.
2.5. Определение концентрации белка
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле ПААГ в денатурирующих условиях
2.7. Измерение деяцетилязной яктивиогти
2.8. Определение оптической плотности ОП.
2.9. Приготовление сред для культивирования
2 Приготовление буферов
2 Тонкослойная хроматография ТСХ.
2 Ионообменная хроматографии.
2 Гидрофобная хроматография
2 Гельфильтрация
2 Культивирование микроорганизмов
2 Определение ферментативной активности
2 Определение фунгицидной активности.
Г лава 3. Экспериментальные результаты
3.1. Сравнение результатов, полученных при калибровке различных колориметрических методов определения концентрации сахаров
3.2. Выбор способа измерения хитиназной активности
3.3. Vii . X его выделение и идентификация хитиназной активности
3.4. Таксономия и морфологические характеристики исследуемого штамма
3.5. Рост Vii . X на синтетической среде.
3.6. Особенности культивирования Vii . X.
3.7. Рост на крахмале и накопление амилазной активности.
3.8. Деацетилазная активность
3.9. Рост на других субстратах.
3 Устойчивость к антибиотикам
3 Получение ферментативного препарата.
3 Анализ белков культуральной жидкости Vii . X.
3 Выделение хитиназы В
3 Выделение хитиназы А
3 Состав белков культуральной жидкости при выращивании Vii . X на различных средах
3 Выделение хитнназСиО
3 Свойства хитиназ Vii . X
. Зависимости активности от температуры, и
ионной силы среды. Ю
. Влияние различных ионов на активность ферментов Ю
. Действие ферментов на различные субстраты. Ю
3 Анализ продуктов гидролиза хитина хитиназамн Vii . X ЮН
3 Совместное действие хитиназ. Н
3 Индукция хитнназного регулона.
3 Фунгицидная активность Vii . X. И
3 Сравнение Vii . X с i 8 и опенка
его перспектив как продуцента хигиназы И
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Сравнение выделенных хитиназ с другими хитиназамн
Vii.
4.2. Изменение ростовой среды в процессе культивирования
4.3. Изменение спектра синтезируемых хитиназ с течением времени
4.4. Влияние начального ростовой среды на индукцию
хитиназного комплекса Vii . X.
4.5. Построение математической модели роста Vii . X и накопления ферментативном активности.
4.6. Перспективы использования Vii . X как продуцента хитиназы.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Оптимизация условий культивирования бактерии с целью достижения максимального накопления ферментативной активности в культуральной жидкости. Изучение легального строения хитинолитического комплекса Vii . X и особенностей его функционирования. Выделение индивидуальных ферментов хитиназ Vii . X и изучение их свойств. Изучение механизма индукции хитиназного комплекса Vii . Оценка перспектив использования исследуемого штамма как продуцента хитинолитических ферментов, а также, как фунгицидного агента. Разработка математической модели функционирования ферментативного комплекса Vii . X в процессе роста клеточной массы и индукции ферментативного комплекса. Научнопрактическая значимость результатов. Показано, что Vii . X является перспективным продуцентом хитииолитических ферментов При использовании методов, широко используемых в биотехнологии, получен ферментативный препарат высокой активности. Продемонстрирована значительная фунгицидная активность штамма в отношении фитопатогенных грибов, принадлежащих к родам i, ii, ii и другим. Выделены четыре хитиназы различной специфичности действия. При этом эндохитиназы А и С не имеют аналогов среди исследованных хитиназ представителей рода Vii. Получены результаты, свидетельствующие о возможной важной роли ферментативного деацелгилирования промежуточных продуктов гидролиза хитина в регуляции активности хитинолнтического комплекса, что существенно расширяет наше понимание происходящих при этом процессов. Построена математическая модель роста клеточной биомассы и накопления ферментативной активности в культуральной жидкости, адекватно описывающая особенности исследуемого штамма и предлагающая новые подходы к увеличению продукции хитииолитических ферментов. Основные положения, выносимые на защиту. Выделен бактериальный штамм, являющийся перспективным продуцентом хитииолитических ферментов. Хитинолитический комплекс Vii . X включает четыре хитиназы различной специфичности действия При этом сравнение с литературными данными показало, что выделенные эндохитиназы не имеют аналогов среди изученных хитиназ бактерий рода Vii. Впервые выдвинуто предположение о возможной роли деацегилирования хитоолигосахаридов бактериальными внеклеточными деацетилазами. А именно об их участии в регуляции активности хитиполитического комплекса. Структура диссертации. Диссертация изложена на 9 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение и выводы. Работа иллюсгрирована рисунками, таблицами и 6 схемами. Список литературы содержит 9 названий работ на русском и английском языках. Глава 1. Обзор литературы. Хитин. Распространение хн 1 инн н природе. Полисахариды являются одними из наиболее распространенных веществ природного происхождения. В живых организмах они выполняют функции структурного элемента, резервуара питательных веществ, а также многие другие. Примеры некоторых широко распространенных представителей полисахаридов, с указанием химического строения и функций, приведены ниже. Таблица 1. Степаненко, . Полисахарид. Химическое строение Функция. I. Агароза Чередующиеся рЭгалактопиранозы и 3,6 ангидро аЬгалактопиранозы, связанные поочередно 4 и а связями. Основной компонент Агарагара, который осуществляет прочное сцепление клеток красных водорослей между собой. Альгиновые кислоты Остатки Оманнуроновой и Ьгулуроновой кислот, связанные П1 4 связями. Главный егруктурный элемент клеточных стенок бурых водорослей. Амилоза Остатки аО глюкопирамозы, связанные связями. Основной компонент крахмаларезервного вещества в клетках растений. Амилопектин Фрагменты амилозы около моносахаров, связанные а связями. Разветвленный полисахарид, компонент крахмала. Гепарин полисахаридная часть Чередующиеся остатки аОглюкозамина и РЭглюкуроновой или аГидуроновой кислоты, связанные связями Большинство остатков глюкозамина сульфатировано по аминогруппе и 3 ОН, а уроновой кислоты по 2 ОН группе. Основа прогеогликана соединительной ткани, обладающе1 о антикоагулятным и гнполипидсмическим действием.