Исследование аберрантной экспрессии рековерина

• Автор: Савченко, Марина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Рековерин и другие паранеопластические антигены

1. Рековерин.

1.1. Рековерин как белок зрительной трансдукции

1.1.1. Тканевая и клеточная локализация

1.1.2. Основные характеристики

1.2. Рековерин как паранеопластический антиген

1.2.1. Аберрантная экспрессия рековерина в опухолях

и клеточных линиях

1.2.2. Современные представления о причинах развития парансопластичсской дегенерации сетчатки у онкологических больных.
1.2.3. Модельные системы САЯсиндрома.
1.2.4. Механизмы паранеопластической дегенерации сетчатки
1.2.5. Влияние аберрантной экспрессии рековерина
на процессы, происходящие в раковых клетках.
2. РНКсвязывающие белки и соответствующие им неврологические синдромы
2.1. Ниантигены
2.2. Блантигсны
3. ДНКсвязывающий белок Уоангиген и паранеопластическая дегенерация мозжечка
4. Потенциалзависимые кальциевые каналы и миастенический синдром ЛамбертаИтона
5. Потенциалзависимые калиевые каналы и нейромиотония.
6. Ацстилхолиновый никотиновый рецептор и миастения.
7. Амфифизин и синдром скованного человека
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Реактивы.
2. Материалы
3. Аналитические процедуры
3.1. Определение концентрации белков
3.2. элсктрофорез в полиакриламидном геле.
3.3. Нативный электрофорез в полиакриламидном геле
3.4. Иммуноблоттинг.
3.5. I
3.6. Цитоиммуногистохимический анализ серийных
парафиновых срезов опухолевых тканей.
4. Получение рекомбинантного миристоилированного рековерина
5. Получение иммобилизованных белков
6. Выделение поликлональных моноспецифических антител против рековерина.
7. Культивирование клеточных линий
8. ПЦР с обратной транскриптазой
9. Количественный ПЦР с обратной транскриптазой.
. Анализ уровня метилирования ДНК при помощи бисульфитного сиквенса
. Выделение р из тканей крысы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Рековсрии в раковых опухолях и нормальных тканях
1.1. Экспрессия рековерина в злокачественных опухолях
1.1.1. Иммуногистохимичсский анализ срезов опухолей легких
1.1.2. Анализ экспрессии мРНК рековерина в раковых опухолях
1.2. Экспрессия рековерина в нормальных тканях.
2. Исследование механизмов аберрантной экспрессии рековсрина
2.1. Анализ статуса метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях и раковых опухолях.
2.2. Исследование влияния различных агентов на уровень экспрессии рековерина в клеточной линии рака легких.
2.2.1. Влияние ДАЦ, ТСА и бутирата натрия на уровень экспрессии мРНК рековерина
2.2.2. Изменение уровня метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в ИС1Н под воздействием ДАЦ.
2.2.3. Исследование влияния ДАЦ, ТСА и бутирата натрия
на уровень экспрессии рековерина
3. Рековерин как потенциальный маркер злокачественной трансфомации
3.1. Серийный анализ опухолей легких на присутствие в них экспрессии рековерина.
3.2. Серийный анализ образцов сыворотки крови онкологических
больных на присутствие аутоантител против рековерина
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На сегодняшний день причиной развития ПНС считается экспрессия злокачественной опухолью белков, которые в норме в отсутствие трансформации не синтезируются тканью, где локализована опухоль. Некоторые из этих белков строго специфичны для нервной ткани, другие могут содержать эпитопы, идентичные эпитопам нейрональных белков. Такие белки называют паранеопластическими онконеврапьными антигенами, или ПНА. Возможный механизм ПНС может сводиться к следующему. Нервная система относится к иммунопривилегированной зоне, т. Но в случае аберрантной экспрессии раковой опухолью белков, специфичных для нервной ткани, их попадание в кровоток вызывает выработку аутоантител против них, поскольку эти белки являются чужими для иммунной системы. Аутоантитела затем преодолевают гсматоткансвый барьер и выводят из строя гот белокантиген, на который они были выработаны, что и приводит к дегенерации ткани 5. Особенный интерес в изучении ПНА представляет тот факт, что заболевания, вызываемые ими, могут быть диагностированы за месяцы или даже за годы до определения у того же пациента раковой опухоли. В связи с этим чрезвычайно важным кажется изучение не столько собственно ПНС и их проявлений, сколько самих ПНА, их свойств и причин, вызывающих их экспрессию в опухоли. Настоящая работа посвящена исследованию одного из ПНА, рековерина, аберрантная экспрессия которого в опухолях может приводить к развитию специфического ПНС паранеопластической дегенерации сетчатки. Рековерин. Рековерин это Са2связывающий белок, принимающий участие в фототрансдукции 6. С другой стороны, рековерин известен как ПНА, ответственный за развитие паранеопластической дегенерации сетчатки при раке 7. Рековерин как белок зрительной трансдукции. Рековерин представляет собой Са2связывающий мономерный белок с кажущейся молекулярной массой кДа, определнной по величине его электрофоретической подвижности 6. Аминокислотная последовательность рсковсрина, установленная на основании последовательности его кДНК, содержит 2 аминокислотных остатка и имеет расчтную Мг, равную ,3 кДа 6, 8. ЫКонец рековерина содержит мотив, который служит сигналом для присоединения к остатку глицина ацильной группы, при этом Ыконцевой остаток метионина отщепляется, а ацилированный остаток глицина становится Ыконцсвым. Таким образом, ацилированная молекула рековерина содержит в свом составе 1 аминокислотный остаток и имеет молекулярную массу, равную ,4 кДа. Тканевая и клеточная локализация. Впервые рековерин был обнаружен в сетчатке быка , 6, 9. Рсковерин высокоспецифичен для сетчатки и кроме нее выявлен только в эпифизе, который содержит клетки, близкие к фоторецепторным клеткам сетчатки , пинеалоциты. Существуют также данные о том, что слабая рековеринположительная реакция выявляется в обонятельных клетках крысы . У миноги ЬатргеамшНб рековерин обнаружен и в амакриновых клетках сетчатки . В фоторецепторных клетках сетчатки млекопитающих рековерин содержится в наружных сегментах палочек и колбочек 6, а также в нейронах более высокого порядка в биполярных и ганглиозных клетках сетчатки целого ряда видов , , , . Показано, что в наружных сегментах палочек и колбочек рековерин Са2зависимым образом регулирует фосфорилирование родопсина, ингибируя активность родопсинкиназы. В темноте, при высокой концентрации кальция, рсковерин связан с мембранами и взаимодействует с родопсинкиназой, что приводит к ингибированию активности фермента. На свету, при снижении концентрации кальция, рековерин диссоциирует из комплекса с мембранами и родопсинкиназой. В свою очередь, родопсинкиназа фосфорилируст родопсин, что приводит к его выключению , , . Молярное соотношение рековеринродопсин в фоторецепторной клетке выглядит как 14 . Кроме того, присутствие рековерина обнаружено во внутренних сегментах и окончаниях аксонов фоторецепторных клеток 6, , однако какихлибо экспериментальных данных, указывающих на функцию рековерина в этих отделах фоторецепторов или хотя бы экспериментально обоснованных гипотез на этот счет, до сих пор нет.