Роль холестерина в возрастном изменении микровязкости и активности ферментов плазматической мембраны Acholeplasma laidlawii

• Автор: Иванова, Валерия Федоровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 c. : ил

ВВ1ЩЕНИЕ
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Влияние холестерина на микровязкость мембраны
1.2. Влияние холестерина на активность мембранных ферментов
1.3. Возрастные изменения биологических мембран
1.4. Старение эукариотических и прокариотических клеток в культуре
1.5. Биохимия и старение клеток микоплазмы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изменение липидного состава мембран в процессе роста культуры А.1а1й1а?11
3.1.1. Определение фаз роста культуры
3.1.2. Исследование состава мембранных липидов в процессе роста культуры
3.2. Изменение микровязкости мембран А.1а1(11аVII в процессе роста культуры
3.3. Изменение активности мембраносвязанных ферментов и глюкоз освязывающе го белка с возрастом культуры
3.4. Выделение и очистка АТФазы и глюкозосвязывающего белка из мембран[Д.1а1<11а?у11 и их
характеристика
3.4.1. Получение препаратов ^ -фактора и
комплекса АТФазы

3.4.2. Структурные и каталитические свойства Гд- и *0-г1 АТФазы
3.4.3. Выделение глюкозосвязывающего белка
3.5. Влияние холестерина на физико-химические
свойства протеолипосом
ГЛАВА 4. ОБСУЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ - аденозинтрифосфат
АИФ - аденозиндифосфат
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ДЭАЭ - целлюлоза-диэтиламиноэтилцеллюлоза
ТХУ - трихлоруксусная кислота
НДЦН - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид ТЭМЭД - н,и*л,,ы'- тетраметилендиамин
- неорганический фосфат ддС-Ыа - додецилсульфат натрия ДВДП - N,N дициклогексилкарбодиимид
5- иэ - 5-доксилстеариновая кислота
6—10 - 6-Ю-доксилпалшитиновая кислота СМ2 - спинмеченое производное карболина
1т^1392 ~ СООТйОП1ение интенсивностей флуоресценции эксимеров и мономеров пиреяа V - максимальная скорость ферментативной реакции
- константа Михаэлиса
Н+-АТФаза - протонтраяслоцируюшая аденозинтрифосфатаза
Рх -фактор - гидрофильная часть АТФазы, растворимая АТФаза
?0 -фактор - гидрофобная часть АТФазы
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

элюцию линейным градиентом ионной силы от 10 до 600 мМ трис-НС1, pH 7,8, 20% метанол с использованием градиентного смесителя Н ІЛІга§гай ЬКВ" (ШввЦИЯ) СО СКОРОСТЬЮ 80 МП/ЧЭС В Т6ЧЄНИЄ
час. Элюат собирали фракциями по 20 мл. В каждой фракции определяли концентрацию белка и АТФазную активность.
Ступенчатую элюцию проводили 600 мл 0,3 М трис-ЇЇСІ буфера, pH 7,8, содержащего 20% метанол. Белок, полученный ступенчатой элюцией, концентрировали высаливанием сульфатом аммония (80% от насыщения). Высаливание проводили при 4° в течение I часа при постоянном перемешивании. Затем суспензию центрифугировали при 10000 в в течение 10 мин, осадок суспендировали в 2 мл раствора Г.
Препарат, полученный высаливанием, наносили на колонку (1,2x55 см) с сефарозой 6 В, уравновешенную раствором Г. Элюцию проводили тем же раствором со скоростью 10 мл/ч. Элюат собирали фракциями по 5 мл. Фракции, обладающие активностью, собирали и концентрировали до минимального объема на фильтрах Ш-Ю ("Атісоп", США).
2.21. Выделение АТФазного комплекса
Для солюбилизации фермента мембранную суспензию обрабатывали неионным детергентом - тритоном Х-100. Суспензию мембран в среде Б с концентрацией белка 20 мг/мл смешивали с равным объемом 4% тритона Х-100, приготовленного на той же среде, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Для отделения весо-любилизированных мембран смесь центрифугировали при 105000ё в течение 40 минут. Надосадочвую жидкость, содержащую солюбилизированный белок, использовали для дальнейшей очистки.
На колонку (2,5x10 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52), уравно-