Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа: роль в регуляции энергетического обмена, индукции апоптоза и агрегации белков

• Автор: Плетень, Анатолий Петрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 339 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ 3

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ6

1.ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИДЗФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА

ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА7

2. ОСНОВНЫЕ СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ШАПЕРОНОВ.

3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕНАТУРАЦИИ БЕЛКОВ И ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ.

4. НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД3

ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.7

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.8
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ6
1. РАЗОБЩЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА ПРИ ИНДУКЦИИ АЦИЛФОСФАТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД3ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.6
2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГАФД С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ. 1
3. ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИДЗФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ ИНДУКЦИИ АПОИТОЗА.5
4. БЛОКИРОВАНИЕ ШАПЕРОНИНА НЕНАГИВНЫМИ
ФОРМАМИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕТ ИДЗФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ 1
5. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ, ИНАКТИВИРУЮЩИХ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИДЗФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗУ, И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА9
ВЫВОДЫ .6
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Неравноценность связывающих участков следует также из отличий в скорости присоединения 4 эквивалентов кофермента. Первая молекула взаимодействует с белком за время, меньшее 3х миллисекунд, а полное насыщение апофермента кофактором происходит через 1 сек. Это доказывает, что последовательное связывание индуцирует развивающиеся во времени конформационные перестройки фермента, которые и лежат в основе наблюдаемой отрицательной кооперативности по связыванию кофактора. Изучению параметров связывания с ГАФД посвящено меньшее число работ. Изза неспособности образовывать комплекс с переносом заряда с 9, этот кофактор обладает меньшим сродством к ферменту. М для участков прочного связывания и 1 мкМ для участков непрочного связывания 6, 8. Несмотря на сходство структуры, гомологичные ферменты обнаруживают разный характер кооперативности при связывании кофактора. В случае дрожжевого фермента кооперативное связывание наблюдается лишь в определенных условиях при температуре С и 8,5, причем связывается с положительной кооперативностью 6, 7. Тогда как ГАФД из скелетных мышц кролика , , , осетра 0, 0, ГАФД из мышц лобстера , из Е. В. . . Повидимому, характер кооперативности определяется особенностяхми четвертичной структуры фермента и междоменных взаимодействий. Необходимо отметить, что кооперативный характер связывания кофактора в очень большой степени зависит от условий эксперимента. Так, для ГАФД из мышц кролика при повышении среды до 9,4 наблюдается полное исчезновение кооперативности константы диссоциации для всех связывающих участков становятся равными 0,8x6 9. Отрицательная кооперативность дегидрогеназы в отношении исчезает в присутствии ацетилпиридинадениндинуклеотида. Добавление , , АМР приводит к существенному ослаблению кооперативных взаимодействий между активными центрами 9, 0. Описанные выше экспериментальные данные во многом соответствуют объяснению феномена отрицательной кооперативности, предложенному Кошландом , 7, 8 на основании разработанной им ранее модели. Связывание кофермента в одной субьединице уменьшает сродство к нему активных центров других субъединиц, следовательно, конформация субъединиц в тетрамере последовательно изменяется по мере связывания кофактора. Таким образом, связывание лиганда с одной из субъединиц олигомера индуцирует в ней последовательные конформационныс изменения, которые перестраивают структуры межсубъединичных контактов, изменяют конформации соседних субъединиц, в результате чего мы наблюдаем кооперативный эффект. В то же время экспериментальные наблюдения Бернхарда в основном связанные с эффектом полуцентровой реактивности о которой речь пойдет ниже привели его к представлению о предсуществующей ассиметрии апофермента дегидрогеназы, возможно вызванной различными взаимодействиями между субъединицами , 5, 6, 7. Такая функциональная ассиметрия тетрамера, организованного как димер димеров, и в то же время состоящего из химически идентичных субъединиц, позволяет объяснить существование активных центров с разным сродством к кофактору. Кристаллографические исследования, выполненные на ГАФД из мышц лобстера показали, что субъединицы ассиметричны, и, таким образом, подтвердили модель предсуществующей ассиметрии фермента , , 8. Несколько исследований, проведенных на дегидрогеназе осетра в растворе были рассмотрены в соответствии с моделью предсуществующей ассиметрии 0, 0. Для ГАФД В. Г кооперативность связывания кофактора была описана в соответствии с моделью Кошланда , 2. Для апо и холоформы этого фермента характерна молекулярная симметрия 2, однако, конформации дегидрогеназы в двух состояниях значительно отличаются. В то же время структура тетрамера, содержащего одну молекулу кофактора, ассиметрична. При этом субъединица со связанным коферментом близка по своей конформации к субъединицам холофермента, а свободные от кофактора субъединицы к субъединицам аподегидрогеназы. Эти результаты свидетельствуют о том, что связывание лиганда индуцирует последовательные конформационные изменения в дегидрогеназе из В. Г 2,3.