Исследование мембранно-связанного белкосинтезирующего аппарата хлоропластов гороха

• Автор: Безсмертная, Ирина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О МЕМЕРАН0СВЯЗАНН0М

АППАРАТЕ ТРАНСЛЯЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ.

1.1. Мембраносвязанныв рибосомы хлоропластов .

1.2. Вопрос о продуктах синтеза мембраносвязанных рибосом

1.3. Участие цитоплазматической и хлоропластной белоксинтезирунвдих систем в организации внутренних мембран хлоропластов

1.4. Формирование белоксинтезиругащей системы

при диференцировке пластид .

1.5. Структурная организация и химический состав внутренних мембран хлоропластов

в онтогенезе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Объект исследования.
2.2. Выделение хлоропластов
2.3. Получение фракций хлоропластных
мембран
2.4. Обработка мембран хлоропластов детергентами
2.5. Обработка мембран хлоропластов ферментными препаратами
2.5.1. Обработка мембран хлоропластов
трипсином
стр.
2.5.2. Обработка субмембранных фракций хлоропластов рибонуклеазой
2.5.3, Обработка субмембранных фракций хлоропластов дезоксирибонуклеазой
2.6. Определение белка и хлорофилла во фракциях мембран хлоропластов .
2.7. Определение РНК во фракциях мембран хлоропластов
2.8. Включение Саминокислот в белки мембранных фракций хлоропластов .
2.9. Получение надосадочной жидкости
из хлоропластов гороха
2Выделение рибосом из клеток .i штамм 0
2Выделение высокомолекулярной РНК из
мембран хлоропластов.
2 Фракционирование РНК в полиакриламидном
2 Выделение РНКмаркера из рибосом .i
штамм 0 .
2 Электронномикроскопические методы.
2Используемые реактивы.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.
3.1. Исследование локализации белоксинтезирующего аппарата, связанного с мембранами зрелых хлоропластов .
3.1.1. Выделение и электронномикроскопическое исследование двух типов мембран хлоропластов
3.1.2. Содержание белка и РНК в мембранных фракциях хлоропластов.
стр.
3.1.3. Белоксинтезирующая функция двух типов мембран хлоропластов
3.1.4. Электронномикроскопическое исследование мембранных фракций хлоропластов, полученных после обработки детергентами
3.1.5. Выделение рибосом из мембранных фракций хлоропластов
3.1.6. Электрофоретическое разделение РЖ, выделенной из мембран хлоропластов
3.1.7. Обсуждение результатов
3.2. Исследование белоксинтезирующего аппарата , связанного с первичными мембранами хлоропластов гороха.
3.2.1. Выделение из хлоропластов фракции первичных мембран.
3.2.2. Электронномикроскопическое исследование изолированных первичных мембран хлоропластов .
3.2.3. Выделение из первичной мембраны хлоропластов предфрет и их электронномикроскопическое исследование
3.2.4. Исследование химического состава изолированных предфрет .
3.2.5. Белоксинтезирующая функция структур, изолированных из первичных мембран хлоропластов
3.2.6. Обсуждение результатов .
ВЫВОДЫ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Перечисленные агенты освобождают, главным образом, мономеры рибосом, в то время как под действием неионных детергентов нонидета или тритона Х0 кроме рибосом и полисом освобождаются еще так называемые псевдополисомы полирибосомные частицы, несущие некоторое количество белкового материала мембран, который , по мнению авторов,
может представлять центры связывания рибосом с мембраной. Определение мембранного фрагмента, приходящегося на одну рибосому, в
случае выделения с помощью нонидета составляло 3 х Да, а в случае тритона Х0 6 х Да i, i, i, v,i,0 . Наиболее полное освобождение полирибосом от фрагментов мембран достигается при совместном действии протеаз с детергентами И ОДНИХ протеаз . При сравнительном изучении воздействия трипсина и химотрипсина на мембрану хлоропластов было установлено, что первый значительно эффективнее, чем второй i, . Изучение роди мембраносвязанных рибосом в белковом синтезе, их структуры и особенностей функционирования невозможны без исследования локализации их в сложной системе внутренних мембран хлоропластов. Сведения об их локализации, полученные ранее, главным образом, при электронномикроскопическом исследовании срезов листьев противоречивы по одним данным, они расположены на боковой поверхности тилакоидов хлоропластов кливии Мину ль ска и др. Кислякова и др. Ра1к, ХатотоЪо ей а1. Молчанов, Мезенцев, . Наиболее плодотворным решением задачи локализации и организации мембраносвязанных полирибосом оказалось выделение их из фракции мембран хлоропластов путем постепенной разборки мембран с помощью детергентов. Изолированные мембраны хлоропластов обрабатывали детергентами и затем центрифугировали в линейном или ступенчатом градиенте сахарозы и полученные фракции структур исследовали под электронным микроскопом. Таким путем были выявлены основные стадии постепенного освобождения тилакоидов гран от липопротеидного материала. Оказалось, что при действии детергентов центральная часть тилакоидов гран гораздо более уязвима, чем периферическая. Вследствие этого обработка 0,5 ЮХКа приводит к получению из гран кольцевых структур, из которых при действии 0,1 тритона Х0 освобождаются имеющие ту же форду структуры, состоящие из частиц. Эти состоящие из частиц кольцевые структуры были идентифицированы как полирибосомы по всем, существующим тестам коэффициент седиментации Б , величина частиц, соотношение РНКбелок, чувствительность при мягкой обработке РНКазой, окрашиваемость уранилацетатом, способность к обратимой диссоциации на две неравные субчастицы и функция Филиппович и др. Это дало возможность сформулировать положение о том, что полирибосомы локализованы не на поверхности мембран, а внутри тилакоидов гран. В принципе, это вполне согласуется с теми электронномикроскопическими данными, согласно которым рибосомы тяготеют к боковой поверхности тилакоидов Д1икульска и др. Кислякова и др. Такое расположение рибосом скорее всего является следствием примененных при подготовке срезов обработок многократное обез
воаивание этанолом и ацетоном, экстрагирующих липиды и липопротеиды и денатурирующие белки, приводящих к истончению мембран. В результате рибосомы частично или полностью освобождаются от материала мембран периферической части тилакоидов гран и оказываются на границе тилакоидов и стромы. Имеющиеся в литературе сведения лишь о частичном освобождении рибосом ИЗ мембран хлоропластов ii при действии агентов, снимающих рибосомы с поверхности мембран высокая концентрация солей и пуромицин , также подтверждают это положение . Солюбилизация липидного материала мембран хлоропластов молодых растений позволила обнаружить гигантские полирибосомы, состоящие из большого числа колец, каждое из которых локализовано внутри гранального тилакоида и составляет его остов. Такая структурная организация мембраносвязанных полирибосом в зрелых хлоропластах является уникальной и характерна только для определенного вида мембран хлоропластов тилакоидов гран, которые в природе также неповторимы Филиппович и др. Филиппович, ivi . Не исключено, что кроме этих подирибосом , вмонтированных в тилакоиды гран, в зрелых хлоропластах существует другой или другие виды связанных с мембранами полирибосом. Однако, определенных доказательств их существования в литературе пока нет. В изолированных хлоропластах синтез белка осуществляется, в основном, мембраносвязанными полирибосомами Филиппович и др.