Исследование биологических свойств ангиогенина молока - полифункциональной рибонуклеазы

• Автор: Рустамьян, Юлия Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Струюура и свойства ангиогенина из коровьего молока

1.1.1. Структура и физикохимические свойства.

1.1.2. Ферментативная активность.

1.1.3. Известные физиологические свойства

1.1.3.1. Ангиогснная активность

1.1.3.2. Ангиогенин как иммуномодулятор

1.1.3.3. Цитотоксичность.

1.1.3.4. Антивирусное действие.

1.1.4. Биохимические механизмы биологического действия ангиогенина
1.2. Идентификация ангиогенина.
1.3. Очистка ангиогенина из биологических жидкостей
1.4. Практическое использование ангиогенина
1.5. Заключение к литературному обзору.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Исходные вещества.
2.2. Биологические объекты.
2.3. Препаративные методы
2.3.1. Очистка ангиогенина из коровьего молока.
2.3.2. Выделение рРНК из печени крыс.
2.4. Аналитические методы
2.4.1. Определение Р1 Казной активности пРНКазы А и ангиогенина .
2.4.2. Реакция конкурентного взаимодействия ангиогенина и пРНКазы с плацентарным ингибитором РПКазы.
2.4.3. Белковый БЭБэлектрофорез в ПААГ
2.4.4. Иммунофсрментный анализ.
2.4.5. Определение биологически активных белков молока
2.4.6. Исследование кристаллической структуры белков крови
2.5. Определение ангиогенной активности ангиогенина
2.5.1. Кожная реакция.
2.5.2. Метод микрокармана в роговице глаза крысы
2.6. Исследование фармакокинетики ангиог енина
2.7. Определение продукции лейкоцитами человека интерлейкинов
2.8. Микробиологические методы
2.9. Статистическая обработка полученных данных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Очистка ангиогенина из коровьего молока и его идентификация
Глава 4. Иммуноферментный анализ ангиогенина
Глава 5. Проникновение ангиогенина в кровь животных через ЖКТ
при пероральном введении
Глава 6. Антимикробное действие АНГ молока
Глава 7. Влияние АНГ на репродукцию лейкоцитами крови иммунных
цитокинов.
Глава 8. Характеристика распределения и элиминации ангиогенина молока
в головном мозге и иммунокомпетентных органах животных
Выводы.
Список литературы


Каталитический центр Р1, на котором расщепляются фосфодиэфирные связи, включает три аминокислотных остатка Гис, Лиз и Гис5, положение которых совпадает с таковым соответствующих аминокислотных остатков в АНГ человека Гис, Лиз, Гис4. АНГ человека. Сайт В2, преимущественно связывающий пуриновое кольцо 5 нуклеозида, представлен Глу9 Глу8 для АНГ человека. Не исключено, что с этим связаны определенные функциональные особенности сравниваемых белков. Стридом и соавт. Одноцепочечный полипептид из 3 аминокислотных остатков имеет более высокую, чем ангиогснин1, молекулярную массу кДа. Это обусловлено его гликозилированием при Асн. Обработка Ыгликоназой снижала молекулярную массу на 6 кДа. Показано, что амино и карбоксилконцевые остатки представлены пироглютаминовой кислотой и пролином соответственно. Идентичность ангиогенина2 с ангиогснином1 составляет . У всех известных ангиогенинов имеется три дисульфидных мостика, которые определяют довольно жесткую пространственную структуру молекулы, вследствие чего она устойчива к механическим воздействиям, действию протеаз и низким значениям . Китайскими исследователями в коровьем молоке найден еще один ангиогенный белок, названный ими лактогенином Уе щ а1. Его молекулярная масса кДа, то есть несколько выше, чем бычьего ангиогенина1. По своей первичной структуре лактогснин более гомологичен с щелочной рибонуклеазой из печени быка, чем с найденными в коровьем молоке ангиогенными белками. Наличие изоформ ангиогенина может быть связано с разными генами, поскольку в геноме быка их два, а также, возможно, с посгтрансляционными химическими модификациями , . Ферментативная активность. Ангиогенины обладают рибонуклеазной активностью, отличной от действия панкреатической РНКазы А, что выражается, прежде всего, в их субстратной специфичности i Ii, , i i, i . . . Ангиогенины не расщепляют субстраты, характерные для панкреатической РНКазы А, вчастности, РНК зародышей пшеницы, некоторые синтетические полинуклеотиды, а также гибриды РНКДНК, двухцепочечные полирибонуклеотиды, 2,5связанные динуклеотиды. В то же время ангиогенины из различных источников проявляют ограниченную рибонуклеазную активность относительно и рибосомных РНК. При изучении влияния ангиогенина на препарат РНК из опухолевых эпителиальных клеток аденокарциномы толстой кишки человека НТ, состоящий, восновном, из и рРПК и нуклеотидов соответственно, с помощью электрофореза в агарозном геле обнаружено, что ангиоген и н расщепляет рРНК на продукты, состоящие из 00 нуклеотидов, которые образуются уже через минут, и более глубокий гидролиз при увеличении времени инкубации до 4 часов не происходит. Ангиогенины из коровьего молока так же, как и ангиогенин человека, обладают ограниченной рибонуклеазной активностью. Изоформы ангиогенина молока несколько различаются между собой как активностью, так и субстратной специфичностью. Рибонуклсазная активность ангиогенинов молока относительно такого легко гидролизуемого РНКазой А субстрата, как высокомолекулярная дрожжевая РНК, оказалась весьма незначительной Биудот е а1. При р6,8 этот показатель ниже в х 4 раз, а при 8,0 более, чем в миллион раз. Транспортную РНК тРПК ангиогенины из молока гидролизуют, но значительно слабее, чем РНКаза А, причем активность ангиогенина1 ниже ангиогенина человека, но выше ангиогенина2. Так, если этот показатель для РНКазы принять за 0, то для ангиогенина человека он составляет 0,2, бычьего ангиогенина1 0,, бычьего ангиогенина2 всего 0,5. Отмечена субстратная специфичность ангиогенина2 относительно динуклеотидов. Отличия проявляются как в отношении молочного ангиогенина1, так и ангиогенина человека Табл. Таблица 1. СрА 3. Срв . А 0. Урв 0. Реакционные условия мМ МаС1, мМ 4морфолинэтансуль юкислота, 5. М фермента, 0. М субстрата, 2 ч. Данные для АНГ человека приведены из работы Нагрегапс УаИее, . Изучение ферментативных свойств лактогенина показало, что он активнее ангиогенина1 Уе е1 а1. Его рибонуклеазная активность в 4 раза выше, чем АПГ1 относительно дрожжевой тРНК.