Исследование противоопухолевой активности аутологичных вакцин на основе белков теплового шока in vivo

• Автор: Косенков, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Белки теплового шока. Открытие семейства

1.2. Характеристика семейства белков теплового шока

1.3. Индукция синтеза белков теплового шока

.4. Структура основных белков теплового шока.

1.5. Функции белков теплового шока.

1.6. Особенности биологических активностей белков теплового шока в опухолевой и неопухолевой клетках.

1.7. Участие белков теплового шока в регуляции иммунного ответа

1.7.1. Стимуляция МБР неспецифического иммунного ответа.

1.7.2. Стимуляция НБР специфического иммунного ответа

1.8. Методы лечения онкологических заболеваний.
1.8.1. Основные виды противоопухолевых вакцин
1.9. Белки теплового шока как объекты . для иммунотерапии онкологических заболеваний
1 Использование вакцин на основе белков теплового шока в клинической практике.
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Забор биологических образцов
2.2. Перевивка опухоли.
2.3. Выделение и очистка белков теплового шока.
2.4. Дотблот
2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях
2.6. Вестернблот
2.7. Иммуноферментный анализ.
2.8. Определение цитотоксической активности полученных фракций .
2.9. Определение стимуляции синтеза ДНК
2 Определение содержания эндотоксина.
2 Определение неспецифического иммунного ответа на аутологичные белки теплового шока в клетках моноцитарномакрофагапьного ряда
2 Иммуногистохимическое исследование.
2 Экспериментальное лечение животных.
2 Оценка эффективности противоопухолевой терапии.
2 Измерение размера опухоли
2 Гистологическое исследование.
2 Окрашивание гематоксилинэозином.
2 Статистика.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выделение и очистка белков теплового шока.
3.1.1. Определение условий гомогенизирования.
3.1.2. Определение условий осаждения белков теплового шока.
3.1.3. Определение условий хроматографирования.
3.1.4. Оценка степени очистки фракций, обогащенных белками теплового шока.
3.1.5. Выбор условий ингибирования протеолитической деградации белков.
3.1.6. Концентрирование фракций, содержащих белки теплового шока, после хроматографии на гепаринсефарозе
3.1.7. Определение содержания эндотоксина в выделенном препарате белков теплового шока
3.1.8. Количественное определение содержания белков теплового шока.
3.2. Анализ цитотоксической активности и стимуляции синтеза ДНК i vi
3.3. Определение неспецифического иммунного ответа на аутологичные белки теплового шока в клетках моноцитарномакрофагального ряда.
3.4. Влияние радиотерапии на продукцию белков теплового шока в опухоли молочной железы.
3.5. Исследование противоопухолевой активности i viv
3.5.1. Выбор опухолевой линии и организация работы с экспериментальными животными
3.5.2. Использовавшиеся показатели оценки противоопухолевой активности
3.5.3. Изучение динамики роста опухоли
3.5.4. Изучение динамики смертности экспериментальных животных.
3.5.5. Гистологическое исследование.
3.5.6. Дополнительные показатели эффективности противоопухолевого
лечения
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Наиболее перспективным подходом к решению данной проблемы является использование аутологичных вакцин, материалом для изготовления которых является опухолевая ткань пациента. Согласно литературным данным, наибольшую противоопухолевую эффективность проявляют аутологичные вакцины на основе белков теплового шока , от англ. Шаперонная функция, которую они выполняют по отношению к множеству опухолевых антигенов, позволяет выделять комплексы, состоящие из белков теплового шока с этими антигенами. Однако до сих пор остается нерешенным вопрос о том, как, при наличии специфического иммунологического стимулятора, повысить иммуногенность опухоли либо ее метастазов. Другим важным недостатком является ограниченное количество сырья, т. В данной работе предложена попытка решить указанные проблемы с целью повышения противоопухолевой эффективности аутологичных вакцин. Эта задача решалась двумя способами. Вопервых, основу получаемой вакцины составляют не один, как в оригинальных исследованиях, а три II , и далее . Это позволяет существенно увеличить набор антигенного материала и расширить его спектр, поскольку указанные белки функционируют в различных компартментах клетки. Вовторых, до хирургического удаления опухоли пациенту проводилась терапия препаратом Онкофер, радиоактивное железо 0,8 , которое избирательно накапливается в опухолевой ткани за счет транспортных систем железа и трансферриновых рецепторов и вызывает образование тромбозов в микроциркуляторном русле. Это, в свою очередь, вызывает гипоксический стресс в опухолевой ткани, что способствует усилению экспрессии , стрессовых антиапоптотических белков, пополняющих пул объектов, составляющих основу вакцины. Цель исследования изучение противоопухолевой активности продукта на основе антиапоптотических аутологичных в комплексе с опухолевыми антигенами, а также их комбинации с внешним стрессовым фактором i viv. Разработать методику выделения и очистки комплексов ьопухолевый антиген из опухолевой ткани. Оценить цитотоксичность полученного продукта i vi. Изучить влияние полученного продукта на неспецифичсский иммунный ответ x viv. Оценить возможность использования внешнего стрессового фактора для повышения продукции , как источника иммуногенного материала. Провести сравнительную оценку противоопухолевой активности аутологичных моноирепарат, внешнего стрессового фактора, а также их сочетания. Впервые разработана методика единовременного выделения и очистки пептидных комплексов на основе трех белков теплового шока, показана цитотоксическая безопасность данных комплексов i vi. Продемонстрирована способность полученного продукта активировать неспецифический иммунный ответ x viv в зависимости от используемой дозы и времени. Впервые исследована возможность применения , как внешнего стрессового фактора, с целью повышения содержания белков теплового шока в опухолевой ткани, и впервые доказано, что эффективность комбинации полученного продукта с исследуемым стрессовым фактором i viv является более высокой по сравнению с использованием монопрепаратов. Результаты представленной работы позволяют повысить эффективность использования аутологичных противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока за счет одновременного увеличения количества иммуногенного материала в вакцине и повышения иммуногенности самой опухолевой ткани. Предложена методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока. Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксической активностью по отношению к клеткам линии 7. Полученный продукт дозо и времязависимо увеличивает продукцию в крови больных животных, то есть обладает способностью к активации неспецифического иммунного ответа. Применение , как внешнего стрессового фактора, позволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока материала для аутологичных вакцин. Сравнительная оценка противоопухолевой активности аутологичных комплексов на основе монопрепарат, Ре,атакже их сочетания показала, что наибольшей противоопухолевой активностью обладает комбинированное применение.