Изучение условий биосинтеза, выделения и свойств рестриктазы Sal Gl из Streptomyces albus G.

• Автор: Ла Сын Рён, 0
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Явление рестрикциимодификации

1.2. Номенклатура и классификация ферментов

систем рестрикциимодификации

1.3. Рестриктазы I типа

1.3.1. Специфичность ферментов I типа .

1.3.2. Взаимодействие ферментов I типа с ДНК

1.4. Ферменты рестрикциимодификации Ш типа

1.4.1. Специфичность ферментов Ш типа .

1.4.2. Механизм действия ферментов Ш типа .
1.5. Рестриктазы П типа
1.5.1. Специфичность рестриктазы П типа .
1.5.2. Свойства ферментов рестрикции П типа
1.5.3. Влияние условий культивирования и состава среды на содержание рестриктаз в биомассе.
1.5.4. Выделение и очистка рестриктаз П типа . Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Аппаратура .
2.2. Материалы
2.3. Бактериальные штаммы и бактериофаг .
2.4. Среды
2.5. Использованные в работе буферные растворы
2.6. Получение ДНК бактериофага .
2.7. Выращивание и разрушение мицелия штамма
. для выделения рестриктазы
2.8. Применение математических методов планирования экспериментов .
Стр.
2.9. Электрофорез ДНК .
2 Определение активности рестриктазы
i .
2 Определение концентрации белка
2 Приготовление об.об. раствора полиэтиленимина
2 Подготовка сорбентов для колоночной хроматографии
2 Очистка рестриктазы i .
2 Оценка неспецифических нуклеаз .
2 Электрофорез белков
21. Электрофорез в денатурирующих условиях
22. Электрофорез нативных белков
2 Определение молекулярной массы методом гельфильтрации
2 Изоэлектрическое фокусирование
2 Определение оптимальных условий для эндонуклеазной реакции .
2 Определение И V
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .
3.1.Изучение условий культивирования .
3.1Л. Исследование влияние фазы роста на содержание рестриктазы i в биомассе
3.1.2. Оптимизация состава питательной среды математическими методами планирования эксперимента
3.2. Исследование условий осаждения ДНК
3.2.1. Фракционирование рестриктазы i
и белка стрептомицинсульфатом
3.2.2. Фракционирование рестриктазы i
и белка полиэтиленимином .
3.3. Исследование условия фракционирования сернокислым аммонием белка и рестриктазы i .
3.4. Выделение и очистка рестриктазы
I
3.4.1. Получение суспензии белков и фермента
3.4.2. Хроматография рестриктазы i
на фосфоцеллюлозе II
3.4.3. Хроматография рестриктазы i
на ДЭАЭтрисакриле .
3.4.4. Хроматография рестриктазы i
на гепаринсефарозе .
3.4.5. Исследование чистоты ферментного препарата
3.4.5.1. Чистота препарата рестриктазы
С1
3.4.5.2. Определение электрофоретической гомогенности .
3.5. Физикохимические и каталитические свойства рестриктазы i
3.5.1. Молекулярная масса
3.5.2. Определение изоэлектрической точки
3.5.3. Исследование влияния различных факторов на активность фермента .
3.5.3.I. Изучение условий оптимальных для проявления активности рестриктазы I .
4 Стр.
3.5.3.2. Влияние концентрации субстрата на скорость его расщепления рестрик
тазой i .
3.5.3.3. Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы i
ВЫВОДЫ ЮЗ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На сегодняшний день из двух составляющих систем рестрикциймодификаций наибольшее практическое применение нашли рестрикционные эндонуклеазы П типа. Рестриктазы в наши дни стали важнейшими инструментами молекулярной биологии, поскольку они дали возможность расщеплять ДНК у специфических нуклеотидных последовательностей. Благодаря этому стало возможным бурное развитие физического картирования ДНК, определение ее нуклеотидной последовательности и, что самое важное, открыло широкие возможности для развития генной инженерии. Все эти успехи стали реальностью в большой степени благодаря открытию рестрикционных эндонуклеаз П типа. Применение в широких масштабах рестрикционных эндонуклеаз делает актуальным поиск новых методов их очистки с целью получения чистых ферментов с большим выходом и за более короткое время. Поэтому большое научное и практическое значение имеют исследования по поиску продуцентов рестриктаз, изучению условий их выделения и очистки. В настоящее время, несмотря на то, что известно большое количество рестриктаз, применяемых в генной инженерии, их свойства недостаточно изучены. Также мало сведений о факторах, влияющих на их биосинтез в клетке, так как в основном рестрикционные эндонуклеазы П типа используются в качестве аналитических инструментов. Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение факторов, влияющих на накопление рестриктазы i культурой , а также разработка методов выделения и очистки из ее биомассы рестриктазы i и изучение некоторых ее свойств. Исследование некоторых физикохимических и каталитических свойств фермента. Научная новизна. Впервые проведена оптимизация состава питательной среды методами математического планирования экспериментов, обеспечивающая высокое накопление рестриктазы i и установлена взаимосвязь между фазой роста культуры . и ее способностью накапливать в биомассе максимальное количество фермента. ДЭАЭтрисакриле вместо ДЭАЭцеллюлозы, который ранее не применялся для очистки рестриктаз. I ИЗ . Определены оптимальные для действия фермента условия проведения реакции, и изучены влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы . Практическая ценность работы. Получены исходные данные, необходимые для создания лабораторного регламента по получению эндонуклеазы рестрикции. Выполненные исследования могут послужить основой для развертывания в КНДР и СССР выпуска этого фермента. Помимо этого, изучение и оптимизация условий осуществления реакции гидролиза ДНК даст возможность более широко и эффективно применять рестриктазу в генноинженерных экспериментах. Глава I. К настоящему времени история обнаружения систем рестрикции модификации у бактерий подробно рассматривается в большом количестве обзоров и проблемных статей ,,,,,,,,6, 7,1,4,5. Следует отметить, что работы по изучению явления рестрикции модификации ДНК актиномицетов пока немногочисленны и относятся главным образом к изучению этого явления на модели е. и некоторых бацилл. Обзор литературы посвящен явлению рестрикции модификации, классификации, свойствам, методам выделения и очистки, а также рассмотрены узнаваемые ими последовательности нуклеотидов. Основное внимание уделяется эндонуклеазам рестрикции П типа, подобным изучаемой в данной работе рестриктазе i. Первые описания явления рестрикциимодификации относятся к началу х годов ,0, когда было открыто явление фенотипической вариации у бактериофагов, заключающееся в изменении эффективности посевов фага на различных штаммах бактерий в зависимости от хозяина, на которых выращивался фаг. Эффективность посева максимальна на том штамме, на котором фаг выращивался в последний раз, на других штаммах эффективность посева может варьироваться в пределах нескольких порядков. Однако, если взять фаг из негативной колонии, выросшей на рестриктирующем хозяине, то он уже не ограничивается на этом хозяине. Фаг приобретает модификацию. Если же модифицированный фаг пропустить через цикл роста на исходном штамме, то модификация утрачивается и фаг снова будет ограничиваться рестрикцирующим хозяином.