Изучение генетического полиморфизма и экспрессия в Escherichia coli гена стерол-14 α-деметилазы Mycobacterium tuberculosis

• Автор: Шавкунов, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с.

Оглавление.

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Цитохромы Р4 .

1.1.1. Общая характеристика цитохромов Р0 . . .

1.1.2. Физические свойства.

1.1.3. Характерные особенности

пространственного строения Р0

1.1.4. Механизм реакций, катализируемых Р4

1.2. Характеристика семейства стероладеметилаз . .

1.2.1. Биологическое значение.
1.2.2. Эволюция семейства 2
1.2.3. Особенности субстратной специфичности
из разных организмов
1.2.4. Механизм функционирования
1.2.5. Стероладеметилаза М. i
1.2.5.1. Общая характеристика.
1.2. 5. 2. Субстратная специфичность
1.2.5.3. Пространственное строение
молекулы МТ .
1.2.6. Азоловые ингибиторы .4
Глава II. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы.
2.1.1. Бактериальные штаммы и клинические изоляты. .
2.1.2. Плазмидные векторы.
2.1.3. Ферменты и другие реактивы.
2.2. Методы
2.2.1. Выделение геномной ДНК М. i.
2.2.2. Получение радиоактивно меченных
олигодезоксинуклеотидов.
2.2.3. Полимеразная цепная реакция
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.2.5. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК
2.2.6. Выделение целевых фрагментов ДНК
из агарозного геля
2.2.7. Гидролиз ДНК специфическими рестрикционными эндодезоксирибонуклеазами рестрикция
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК.
2.2.9. Трансформация клеток .i
2.2 Выделение небольших количеств плазмидной ДНК. .
2.2 Выделение препаративных количеств
плазмидной ДНК
2.2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.2 Экспрессия белка МТ в клетках .i. . .
2.2 Денатурирующий электофорез белков
в полиакриламидном геле.
2.2 Массспектрометрический анализ рекомбинантного белка МТ
2.2 Выделение рекомбинантного МТ
из клеток Е. i
2.2 Определение содержания СОвосстановленной формы методом сканирующей спектрофотометрии
2.2 Определение константы связывания МТ с лигандами методом сканирующей спектрофотометрии. .
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение.
3.1. Изучение генетического полиморфизма в клинических изолятах М. i.
3.2. Клонирование и экспрессия МТ в .i.
3.3. Взаимодействие МТ с азолами.
Заключение
Список цитируемой литературы


Оглавление. Глава I. Цитохромы Р4 . Общая характеристика цитохромов Р0 . Физические свойства. Характеристика семейства стероладеметилаз . Биологическое значение. Стероладеметилаза М. Общая характеристика. МТ . Азоловые ингибиторы . Глава II. Материалы. Бактериальные штаммы и клинические изоляты. Плазмидные векторы. Ферменты и другие реактивы. Выделение геномной ДНК М. Лигирование фрагментов ДНК. Трансформация клеток . Выделение небольших количеств плазмидной ДНК. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Экспрессия белка МТ в клетках . Определение константы связывания МТ с лигандами методом сканирующей спектрофотометрии. Глава III. Результаты исследования и их обсуждение. Изучение генетического полиморфизма в клинических изолятах М. Клонирование и экспрессия МТ в . Взаимодействие МТ с азолами. Список цитируемой литературы. Список сокращений. МТЛК минимальная ингибирующая концентрация ПААГ полиакриламидный гель т. Введение. К началу х годов сложилось представление о туберкулезе как об исчезающем заболевании. По данным ВОЗ, в настоящее время туберкулез лидирует в качестве фактора смертности от инфекционных заболеваний среди взрослого населения в мировом масштабе. Альтернативные курсы химиотерапии могут включать фторхинолоны ципрофлоксацин, офлоксацин, аминогликозиды, олигопептиды капреомицин, циклосерин, тиоацетазон, парааминосалициловую кислоту их использование по большей части дорого, кроме того, многие из них обладают выраженными побочными эффектами. До последнего времени поиск антимиксбактериальных препаратов велся главным образом эмпирически. В частности, в качестве потенциальной мишени для противотуберкулезных препаратов нового поколения рассматривается белок, кодируемый геном v М. из надсемейства цитохромов Р0. Ген стероладеметилазы был обнаружен в году при анализе генома штамма v. У эукариот стероладеметилаза выполняет жизненно важные функции, принимая участие в биосинтезе холестерина клеточной мембраны, а также некоторых регуляторных стероидов. Ингибиторы стероладеметилазы из группы азолов широко используются в клинической практике для лечения грибковых инфекций при этом было показано, что некоторые мутации в гене обеспечивают резистентность патогенных грибков к азолам. Показано, что белковый продукт гена v М. Р0, способен осуществлять деметилирование субстратов СУРдеметилаз эукариот в положении а и ингибируется при связывании азолов таким образом, продукт гена v действительно является стероладеметилазой . Таким образом, стероладеметилазу М. Целью настоящей работы было исследование полиморфизма гена стероладеметилазы в клинических изолятах i i, получение функционально активного белкового продукта и изучение его физикохимических свойств. Изучить наличие аллельных вариантов гена в клинических изолятах М. Выявить точечные нуклеотидные замены в гене М. Экспрессировать ген М. ii i и выделить функционально активный белок. Изучить взаимодействие стероладеметилазы М.