NADH: убихинон-оксидоредуктаза митохондрий: аламетицин как инструмент для изучения внутримитохондриальных ферментов и топография реакционноспособных SH-групп комплекса I

• Автор: Гостимская, Ирина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Способы измерения активности ферментов в интактных митохондриях

Аламетицин как инструмент для изучения внутримитохондриальных

ферментов

Препараты Комплекса I и катализируемые ими реакции

Структура фермента

Гистерезисное поведение Комплекса 1.

Возможные способы регулирования фермента i viv

Реакционноспособность групп в белках.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Препаративные методы
Выделение митохондрий сердца быка
Получение субмитохопдриальных частиц.
Получение препарата активированных и деактивированных
субмитохопдриальных частиц.
Получение препарата изолированного Комплекса 1.
Получение препарата митохондрий сердца крысы.
Получение препарата митохондрий, обработанных аламетицииом
Подготовка препарата митохондрий к электронной микроскопии
Аналитические методы
Измерение малатглутаматоксидазной реакции и величины дыхательного
контроля.
Измерение 3ii активности
Измерение оксидазной активности.
Измерение изоцитратдегидрогепазной активности.
Измерение аконитазной активности
Измерение сукщтатоксидазной активности.
Измерение АТРазной активности.
Изучение набухания митохондрий по изменению светорассеивания
Определение белка.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Влияние аламетицина на свойства препаратов митохондрий,
субмитохондриальных частиц и изолированного Комплекса 1.
Влияние ионов магния на КАйНоксидазную активность митохондрий
Ультраструктура митохондрий сердца крысы, обработанных
аламетицином
Аконитазная и изоцитратдегидрогеназная активности митохондрий
сердца крысы до и после обработки аламетицином
Кинетика деактивации Комплекса I в митохондриях и
субмитохондриальных частицах
Локализация 8Нгруппы, меняющей реакционноспособность при
деактивации Комплекса I.
Общее содержание реакционноспособных 8Нгрупп в препаратах
митохондрий сердца крысы и С4Ч сердца быка.
Реакционноспособность 8Нгруппы Коммекса 1
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Получение препарата изолированного Комплекса 1. Получение препарата митохондрий сердца крысы. Измерение оксидазной активности. Измерение изоцитратдегидрогепазной активности. Измерение сукщтатоксидазной активности. Измерение АТРазной активности. Определение белка. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Комплекса 1. Комплекса I. С4Ч сердца быка. ВЫВОДЫ. ТНБ анион нитротиобензоага. Изучение ферментов внутренней мембраны и матрикса интактных митохондрий сильно осложнено существованием барьеров проницаемости для добавленных извне реагентов субстратов, ингибиторов, возможных регуляторов. Рассмотрим в качестве примера более или менее распространенный прием оценки ферментативной активности Комплекса I дыхательной цени по скорости потребления кислорода митохондриями в присутствии субстрата, окисляющегося зависимой дегидрогеназой цикла Кребса. Измеряемая скорость реакции определяется, по крайней мере, 4 ферментами специфическим переносчиком субстрата из внешней среды в матрикс, зависимой дегидрогеназой, Комплексом I и убихинолоксидазным участком дыхательной цепи. Вклад активности каждого из этих ферментов в измеряемую скорость дыхания чаще всего неизвестен и потребление кислорода в такой системе может служить только качественной оценкой активности Комплекса I, также как и трех других ферментов. Аналогичная ситуация возникает и при измерении активностей других внутримитохондриальных ферментов Комплекса I сукцинат убихиноноксидоредуктазы, 03i, дегидрогеназ цикла Кребса. Применительно к ферментам внутренней мембраны митохондрий указанную трудность обычно преодолевают, используя один из следующих методических приемов. Обработка митохондрий ультразвуком приводит к образованию вывернутых ii фрагментов внутренней мембраны митохондрий так называемые субмитохонлриальные частицы СМЧ, где активные центры Комплекса I, II и 03i оказываются доступны для добавленных субстратов. Мембраны можно также разрушить многократным замораживанием и оттаиванием интактных митохондрий. Наконец, использование поверхностноактивных веществ детергентов позволяет солюбилизировать мембраны и получить высокоочищенные гомогеннодисперсные препараты, для которых проблема проницаемости не существует. Следует, однако, иметь в виду, что каталитические и регуляторные свойства этих ферментов в интактных митохондриях могут отличаться от тех, которые хорошо изучены с использованием препарата вывернутых СМЧ или очищенных препаратов вследствие изменения естественного фосфолипидного окружения, потери белков иили низкомолекулярных компонентов матрикса, специфического, или неспецифического влияния детергентов. В связи с этим представляется актуальным найти способ измерения активности внутримитохондриальных ферментов в интактных митохондриях. В течение многих лет наша руина занимается изучением каталитических и регуляторных свойств митохондриальной ЫАОНубихиноноксидоредуктазы Комплекс I дыхательной цепи. А активная, В деактивированная формы фермента. Молекулярный механизм этого превращения А0переход неизвестен. Переход комплекса в Эформу каталитически неактивную сопровождается появлением чувствительности фермента к 8Нреагентам. Можно предположить, что реакционноспособная БНгруппа АЛЗБИ является мишенью для регуляторного воздействия на фермент природных соединений. В связи с этим установление локализации этой ЯНгруппы Комплекса I в интактных митохондриях матрикс или межмембранное пространство актуальная задача исследования фермента. Настоящая работа имела две цели 1 разработать простой способ измерения активности и характеристики свойств Комплекса I в интактных митохондриях 2 установить локализацию и выяснить реакционноспособность БНгруппы одной из форм Комплекса I. Комплекса I в интактных митохондриях СозбтБкауа, . Используя аламетицин в качестве инструмента, мы показали, что реакционноспособная 8Нгруппа Комплекса I локализована на матриксной стороне внутренней мембраны митохондрий Оозбтэкауа, .