Изучение структуры и молекулярного механизма сокращения чехла бактериофага Т4

• Автор: Серышева, Ирина Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. СТРУКТУРА БАКТЕРИОФАГА Т4 И ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЕГО СБОРКИ

1. Структурная организация и функции компонентов частицы фага Т4

2. Основные принципы и закономерности морфогенеза бактериофага Т4

П. МОРФОГЕНЕЗ ХВОСТОВОГО ОТРОСТКА БАКТЕРИОФАГА Т

1. Морфогенез базальной пластинки

2. Сборка хвостового стержня и чехла .

Ш. СТРУКТУРА И ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СТЕРШИ БАКТЕРИОФАГА Т4

1У. ХВОСТОВОЙ ЧЕХОЛ БАКТЕРИОФАГА Т4 КАП ПРОСТЕЙШАЯ СОКРАТИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА

1. Физикохимические и агрегационные свойства белка хвостовых чехлов
2. Молекулярная организация хвостового чехла .
3. Молекулярный механизм сокращения хвостового чехла
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Штаммы бактериальных культур и бактериофагов .
2. Среды для культивирования бактерий и бактериофагов
3. Выращивание и очистка бактериофагов .
4. Определение титра фага
5. Выделение хвостов бактериофага Т4 .
6. Получение чехольного белка бактериофага Т4 в мономерном состоянии.
Стр.
7. Очистка вил
8. Комплементация i vi
9. Выделение и очистка сокращенных чехлов .
. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
. Аминокислотный анализ
. Аналитическое ультрацентрифугирование
. Аналитическое изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле
. Экстракция связанных с белком нуклеозидтрифосфатов
. Тонкослойная хроматография.
. Метод кругового дихроизма
. Оптическая дифракция электронношкроскопических изображений
. Спектрофотометрические измерения.
. Метод электронной микроскопии
. Определение концентрации белка
. Определение общего фосфора .
П. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Выделение и очистка продукта гена
. Получение и очистка хвостов фага Т4.
Б. Получение и очистка мономера пг.
. Проверка биологической активности препарата чехольного белка.
2. Физикохимические характеристики чехольного белка
. Определение молекулярной массы пг .
Б. Изучение аминокислотного состава пг
. Определение изоэлектрической точки пг
Г. Агрегационные свойства чехольного белка фага Т4
Стр.
3. Определение нуклеозвдтрифосфата, связанного с чехольныл белком.
Л. Идентификация связанного нуклеотида.
Б. Определение количественного соотношения между
пг и нуклеотидом
4. Изучение молекулярной организации изомерных форм чехольного белка методом оптической дифракции .
о. Сравнительное изучение спектральных характеристик
мономера пг и его полимеризационных форм
А. Измерение поглощения изомерных форм чехольного
белка в ультрафиолетовой области.
Б. Изучение структурных перестроек чехольного белка
при полимеризации и в процессе сокращения . .
ОБСУЖДЕНИЕ .
ВЫВОДЫ .
Принятые сокращения
Список литературы


Природа сигнала пока не установлена, но, повидимому, при взаимодействии с рецептором происходит изменение конформации некоторых белков дистальной половинки или, альтернативно, нарушается характер взаимодействия проксимальной половинки фибриллы с комплексом белков базальной пластинки. Короткие хвостовые фибриллы разворачиваются, их длина при этом достигает 0 X 7 и необратимо связываются с другой рецепторной областью липополисахарида 8. В процессе передачи сигнала от проксимальной части длинных фибрилл на короткие фибриллы важную роль играет продукт гена 9, который расположен в углах гексагональной базальной пластинки . Далее происходит перестройка базальной пластинки из гексагональной формы в шестилучевую звезду и вызванное этой трансформацией сокращение хвостового чехла. Причем базальная пластинка остается связанной с чехлом. Сокращение чехла приводит к экспанированию наружу хвостового стержня, который проходит через клеточную стенку, проникает в периплазму и доходит до цитоплазматической мембраны . По крайней мере часть белков пробки базальной пластинки остаются связанными с дистальным концом стержня и обусловливают лизис клеточной стенки . Показано, что лизоцимной активностью обладает компонент пробки базальной пластинки продукт гена 5. ДНК фага из головки по каналу стержня транспортируется в клетку. Точный молекулярный механизм транспорта фаговой ДНК в клетку неизвестен. Такая строгая специфичность взаимодействия сенсорных систем вируса с клеткой и согласованная реорганизация его специализированных структурных компонентов обеспечивают фагу Т4 самую высокую эффективность заражения равную I среди всех известных вирусов. Изучение сборки Тчетных бактериофагов, а также других бактериальных вирусов Л , Р, Р4 и др. Основная проблема морфогенеза заключается в том, каким образом линейная информация, закодированная в генах, реализуется при формировании трехмерных биологических ультраструктур. Ряд надмолекулярных комплексов, построенных в большинстве случаев из идентичных белковых цепей олигомерные ферменты, жгутики бактерий, простейшие палочковидные и изометрические вирусы, удалось после мягкой диссоциации их на составляющие субъединицы вновь реконструировать с восстановлением биологической активности. Процесс сборки таких структур при соответствующих условиях может протекать без экзогенного источника энергии и определяется непосредственно аминокислотной последовательностью самих полипептидных цепей. Процесс спонтанной упорядоченной ассоциации белковых субъединиц в надмолекулярные биологически активные комплексы назван самосборкой II. Ясно, что спонтанная ассоциация биологических макромолекул не может определять формирование всех сложноорганизованных структур клетки. Т4 показало, что сборка компонентов вириона происходит не спонтанно, а находится под контролем дополнительных регуляторных и каталитических факторов как вирусной, так и клеточной природы II, 1. Расчеты показывают, что ДНК фага Т4 способна кодировать около 0 белков среднего размера. В настоящее время на хромасоме фага локализовано 0 генных локусов, причем для 0 из них известны белковые продукты рис. Приблизительно фагового генома составляют так называемые избыточные гены 5, мутации в которых часто не влияют на инфекционный процесс. В состав частицы фага Т4 входит около индивидуальных вирусспецифических белков. Все структурные белки вириона, кодируемые поздними генами фага, синтезируются практически одновременно , . Для транскрибирования поздних генов необходимы два условия модификация клеточной РНКлолимеразы фаговыми белками продуктами генов и , 6, а также наличие одноцепочечных разрывов в молекуле ДНК, возникающих в процессе репликации 9. Почему практически одновременно синтезируемые белки вириона вступают в реакции сборки лишь на определенных ее этапах Ясно, что здесь существует строгая регуляция сборки, основанная на специфических белокбелковых взаимодействиях и кинетическом контроле. Как было сказано выше, формирование простых икосаэдрических вирусов происходит по принципу самосборки. Поэтому сборка этих надмолекулярных структур, имеющих определенную форму и размер, может быть объяснена на основе наличия у субъединиц строго специфических участков взаимодействия.