Изучение комплекса протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда

• Автор: Ярыгин, Денис Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 163 с. : ил

Содержание
ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ

ФЕРМЕНТЫ И ИХ БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ У НАСЕКОМЫХ обзор литературы

I. 1. Запасные белки и протеолитические ферменты яиц

насекомых.

I. 1. 1. Запасные белки главные субстраты пептидогидролаз

яиц насекомых.

I. 1.2. Протеолитические ферменты яиц насекомых.

I. 2. Белковые ингибиторы протеиназ насекомых.

I. 3. Белковые ингибиторы протеиназ тутового шелкопряда

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II. 1. Материал
II. 2. Получение препаратов растворимых белков из грены
тутового шелкопряда.
И. 3. Выделение субклеточных фракций из грены тутового
шелкопряда
II. 4. Определение эндогенной протеолитической активности
в гомогенатах и субклеточных фракциях грены тутового
шелкопряда
II. 5. Определение подклассовой принадлежности
протеолитических ферментов
II. 6. Определение активности эндогенных ингибиторов
протеолитических ферментов в гомогенатах и субклеточных фракциях грены тутового шелкопряда
спектрофотометрическим методом
II. 7. Электрофоретическое фракционирование растворимых
белков фены тутового шелкопряда.
II. 8. Методы выделения и очистки цистеиновых протеиназ и
белковых ингибиторов папаина
II. 8. 1. Гельфильтрация
II. 8. 2. Высокоэффективная жидкостная хроматография .
II. 8. 3. Препаративное изоэлектрофокусирование цистеиновых протеиназ и белковых ингибиторов папаина в слое ультродекса фирмы .
II. 9. Изучение физикохимических характеристик
протеолитических ферментов и белковых ингибиторов пептидогидролаз.
II. 9. 1. Определение молекулярной массы протеолитических
ферментов и белковых ингибиторов протеиназ
.9.1.1. Определение молекулярной массы цистеиновых
протеиназ и ингибиторов папаина из грены тутового шелкопряда методом гельфильтрации
.9.1.2. Определение молекулярной массы цистеиновых
протеиназ и ингибиторов папаина методом электрофореза в полиакриламидном геле.
II. 9.2. Изучение субстратной специфичности цистеиновых
протеиназ грены тутового шелкопряда.
II Статистическая обработка результатов эксперимента
Глава III. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСА ЭНДОГЕННЫХ
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И КОМПЛЕКСА БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ПЕПТИДОГИДРОЛАЗ ГРЕНЫ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА.
III. 1. Гетерогенность эндогенного протеолитического
комплекса грены тутового шелкопряда.
III. 2. Гетерогенность комплекса белковых ингибиторов
пептидогидролаз в фене тутового шелкопряда
Глава IV. ДИНАМИКА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ
ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА.
Глава V. СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ В ЯЙЦАХ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА
Глава VI.
VI. 2.
VI. 4. Глава VII.
VII. 1. VII. 2.
VII. 3.
VII. 4.
VII. 5. VII. 6.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕИНАЗЫ С ОПТИМУМОМ 3,0 ИЗ ГРЕНЫ ТУТОВОГО
ШЕЛКОПРЯДА
Очистка протеиназы с оптимумом 3,0 из фены
тутового шелкопряда.
Определение молекулярной массы протеиназы с оптимумом 3,0 методами электрофореза в полиакриламидном геле и гельфильтрации через ТЭК
Определение подклассовой принадлежности протеазы с
оптимумом 3,0 из фены тутового шелкопряда
Определение субстратной специфичности цистеиновой
протеиназы с оптимумом 3,0.
КОМПЛЕКС БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ПАПАИНА В
ГРЕНЕ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА.
Определение изоэлектрических точек белковых
ингибиторов папаина грены тутового шелкопряда
Гетерогенность комплекса белковых ингибиторов папаина из яиц тутового шелкопряда по величине
молекулярных масс.
Определение субстратной специфичности частично очищенных ингибиторов папаина из грены тутового
шелкопряда
Разделение фракций ингибиторов папаина, полученных методом гельфильтрации, с помощью
изоэлектрофокусирования в слое ультродекса
Определение гомогенности и молекулярной массы ингибиторов папаина методами электрофокусирования. 7 Выявление возможной протеиназымишени для эндогенных белковых ингибиторов папаина грены тутового шелкопряда.
Глава VIII. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ
ИНГИБИТОРЫ ПЕПТИДОГИДРОЛАЗ КАК МАРКЕРЫ
ПРОДУКТИВНОСТИ И ЯВЛЕНИЯ ГЕТЕРОЗИСА У
ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА
VIII. 1. Активность цистеиновых протеиназ и белковых
ингибиторов папаина в грене различных по
продуктивности пород тутового шелкопряда.
VIII. 2. Активность цистеиновых протеиназ в грене родительских
пород и гибридов тутового шелкопряда.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Долгое время функции протеолитических ферментов связывали исключительно с их ролью в деструктивных, катаболитических процессах. Однако роль протеиназ не ограничивается процессами деструкции. Все больший интерес привлекают к себе регуляторные функции этих ферментов в живых организмах. Пептидогидролазы насекомых изучены в меньшей степени, чем у высших животных. Наиболее детально среди них рассмотрены пищеварительные протеиназы. Эти ферменты выделены и охарактеризованы по физикохимическим свойствам, субстратной специфичности, отношению к ингибиторам, регуляции их синтеза и активности у различных отрядов насекомых. За последнее десятилетие увеличилось количество работ, посвященных протеолитическим ферментам из яиц насекомых. Некоторые протеолитические ферменты охарактеризованы по физикохимическим параметрам у таких объектов, как рыжий таракан i i, тутовый шелкопряд x i, плодовая мушка i , домовая муха i, медоносная пчела i i, большой и малый мучной хрущак i i, ii и у ряда других видов насекомых. Рассмотрим современные представления о протеолитических ферментах яиц насекомых более детально. Стремительное развитие зародыша, особенно в период распада желточного материала и синтеза специфических белков тканей будущей личинки, сопряжено с интенсивным белковым обменом в яйцах насекомых. Превращение белков в ходе эмбриогенеза насекомых сопровождается не только полным распадом белковых тел, но и ограниченным протеолизом их Филиппович и др. В связи с этим, изучение протеолитических ферментов в эмбриогенезе насекомых, представляет собою важнейший инструмент выяснения основ клеточной дифференцировки и морфогенеза насекомых. Главным субстратом пептидогидролаз в яйцах насекомых являются запасные белки. Поэтому рассмотрению протеолитических ферментов яиц насекомых необходимо предпослать несколько замечаний об их запасных белках. Основным белком желтка яиц насекомых является вителлин. У насекомых большое количество желточных белков имеет экстраовариальное происхождение и накапливаются развивающимися ооцитами в течение вителлогенеза. Предшественником вителлина в яйцах является вителлогенин. У большинства насекомых вителлогенины синтезируются в жировом теле, затем секретируются в гемолимфу, транспортируются ею в репродуктивные органы самок, где избирательно захватываются и включаются в ооциты с помощью пиноцитоза, при котором рецепторный белок, расположенный на мембране, специфически связывает вителлогенин , . После включения в ооциты вителлогенин превращается в главный запасной белок яиц вителлин, доля которого от суммы всех белков желточного содержимого яиц достигает у различных видов насекомых от до . Огромное содержание вителлинов в яйцах свидетельствует об их важной роли в развитии яиц и зародышей насекомых, прежде всего с точки зрения обеспечения растущего эмбриона соответствующими метаболитами. Вместе с тем в литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что в ходе эмбриогенеза тутового шелкопряда вителлин почти не используется и сохраняется в неизменном виде вплоть до стадии вылупления гусениц а. Одновременно с этим существуют сведения о несомненной резервной функции других невителлиногенных белков в яйцах тутового шелкопряда Иванов, . В настоящее время с различной степенью детализации изучены состав и свойства запасных белков различных видов насекомых. Результаты этих исследований за последнее десятилетие суммированы в
таблице 1. Данные таблицы свидетельствуют о том, что запасные белки насекомых представляют собою высокомолекулярные соединения, содержащие в большинстве случаев в своем составе углеводные и липидные компоненты, а в ряде случаев и остатки фосфорной кислоты. Молекулярные массы нативных запасных белков достигают кДа, однако у многих насекомых молекулярная масса исчисляется кДа см. Исследования субъединичной структуры запасных белков свидетельствует о том, что значительная часть их представлена гетеромультимерами. Так, вителлин тутового шелкопряда при молекулярной массе кДа состоит из четырех субъединиц, из которых две имеют молекулярную массу по кДа и две значительно меньшие по кДа каждая Ii .