Коллагеназа IV типа и ее эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папиллом человека 16 типа

• Автор: Винокурова, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил

Оглавление 1

Введение 5

Глава I Обзор литературы 84

1.1 Общая характеристика ММ1 8

1.2 Структура ММП

1.3 Характеристика подсемейств ММП. Субстратная

специфичность.

1.3.1 Коллагеназы

1.3.2 Желатиназы

1.3.3 Стромелизины

1.3.4 Матриксные металлопротеиназы

мембранного типа МТММП
1.3.5 ММП, не включенные в
подсемейства .
1.4 Регуляция активности матриКсных
металлопротеиназ
1.4.1. Активация матриксных
металлопротеинз
1.4.1.1. Активация ММП химическими
агентами
1.4.1.2. Активация ММП протеиназами
1.4.1.3. Внутриклеточная активация
проММП и проМТ1ММП.
1.4.1.4. Активация проММП2
1.4.2. Эндогенные ингибиторы
матриксных металлопротеиназ.
1.5 Регуляция экспрессии генов ММП.
1.6 Роль ММП при раке.
Глава II Материалы и методы 4 8
исследования.
1.
2.
Использованные материалы
.1.1. Список использованных реактивов
II.1.2 Клеточная модель
II.1.3. Клинические материалы
Методы исследования
.2.1. Исследование туморогенных
свойств клеток
.2.2. Подготовка клеток для
определения коллагенолитической активности
.2.3. Приготовление субстрата
.2.4. Переосаждение коллагена IV
.2.5. Определение коллагенолитической
активности
.2.6. Идентификация коллагеназ XV
типа, с помошью метода
зимографии
.2.7. Одновременное выделение ДНК и
.2.8. Выделение геномной ДНК
.2.9. Выделение продуктов ПЦР из
агарозных гелей с помощью
набора i МР i
.2 Выделение продуктов ПЦР из
агарозных гелей методом электроэлюции
.2 Электрофорез геномной ДНК в
агарозных гелях
.2 Гибридизация
II. 21. Перенос геномной ДНК из геля на
II.22. Получение препаратов ДНК,
меченных Р
.23. Получение препаратов ДНК,
иммобилизованных на фильтрах
А Предгибридизация
Б Гибридизация
В Отмывка
.2 Авторадиография
.2 Исследование экспрессии генов
.21. Реакция обратной транскрипции
РНК и амплификация кДНК.
.22. Полимеразная цепная реакция
.2 Исследование метилирования
.21. Гибридизация по Саузерну
.22. Метилчувствительный ПЦР
.2 Анализ уровня экспрессии мРНК
ТИМП2 в клетках НеЪа до и
после обработки 5азацитидином.
Результаты исследования и их
Глава III обсуждение
Ш.1 Клеточная модель
1.2 Анализ туморогенности клеток
1.3 Идентификация коллагеназ IV
1.4 Определение коллагенслитической
активности по коллагену IV типа
1.5 Обнаружение свободных
эндогенных ингибиторов
1.6 Экспрессия генов ММП2, ММП9,
ТИМП2 и МТ1ММП.
Ш.7 Анализ метилирования СрС
островка промоторной зоны ТИМП
Выводы
Список опубликованных работ по теме диссертации
Список литературы


Тканевые коллагеназы, которые относятся к ММП, играют ключевую роль в развитии этих процессов, поскольку они специфически гидролизуют белки группы коллагена одного из основных компонентов соединительнотканного матрикса. Так, коллагеназа I типа или интерстициальная коллагеназа ММП1 гидролизует фибрилярные интерстициальные коллагеньг I, II и III типов, а коллагеназы IV типа или желатиназы А и В ММП2 и ММП9 гидролизуют коллаген IV типа и рассматриваются как маркеры метастатического потенциала клеток . ., i . . ., V Т. Н., . В настоящее время интенсивно исследуются вопросы, связанные с эндогенной регуляцией активности ММП. На клеточных системах показано влияние различных онкогенов в основном генов семейства на экспрессию металлопротеиназ, однако, механизм их действия недостаточно изучен. V. Вирусы папиллом V высокого риска являются этиологическим фактором возникновения рака шейки матки. Рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности от рака у женщин . Еб и Е7. У больных раком шейки матки обнаруживаются транскрипты генов Еб и Е7 в биопсийном материале. Продукты этих генов полифункциональны и одна из известных функций взаимодействие с белками клеточных геновсупрессоров р и продукта гена ретинобластомы . Тем не менее, функциональный потенциал генов Еб и Е7 остается недостаточно изученным. Так, не исследованно изменение протеолитического потенциала при трансформации клеток этим вирусом, что может служить важным маркером злокачественности. Настоящая работа является продолжением и частью исследований, проводимых в лаборатории биохимии и химической патологии белка НИИ БМХ РАМН и направленных на выяснение роли ММП в многоступенчатом процессе канцерогенеза. Целью настоящего исследования является изучение экспрессии коллагеназ IV типа ММП2 и ММП9, и эндогенных регуляторов ММП2 тканевого ингибитора ТИМП2 и активатора МТ1ММП, как возможных маркеров туморогенного потенциала клеток, находящихся на разных стадиях трансформации. Е7 V клетки. На сингенных крысах линии Фишер исследовать туморогенные свойства трансформированных фибробластов. Исследовать спектр коллагеназ IV типа, экспрессируемых первичными, иммортализованными и трансформированными фибробластами, используя метод зимографии. Исследовать активность коллагеназ IV типа и оценить наличие эндогенных ингибиторов этих ферментов в исследуемых клеточных культурах. Исследовать на уровне мРНК экспрессию ММП2 и ММП9, а также эндогенных регуляторов ММП2 ингибитора ТИМП2 и активатора МТ1ММП. Исследовать метилирование промоторной зоны гена ТИМП2, как возможный механизм подавления транскрипции этого гена в опухолях шейки матки, ассоциированных с V высокого риска. Глава I. Обзор литературы. Общая характеристика ММП. Матриксные металлопротеиназы ММП относятся к семейству цинковых металлопротеиназ. В настоящее время ММП интенсивно исследуются. За последние пять лет опубликовано более работ, связанных с изучением спектра, структуры, свойств и функций ММП в норме и при патологических состояниях . .. . i . ., . V Т. К., . ММП, из которых порядка наиболее изучены. i . . М., . i В. .. . I. Содержат цинк в активном центре и относятся к кальций зависимым протеиназам. Обладают сходной доменной структурой. Последовательность кДНК всех членов этого семейства имеет высокую степень гомологии с кДНК колл. ММП. Проферменты могут активироваться некоторыми протеиназами и химическими соединениями. Промоторные участки генов содержат сходные регуляторные элементы. Согласно субстратной специфичности и структуре все ММП подразделяются на пять подсемейств коллагеназы, желатиназы, стромелизины, мембраносвязанные ММП и другие ММП, которые, в настоящее время, не объеденены в подсемейства Табл. Табл. Ферменты ММП Мол. Да Лат. Колллагены 1I, VII, VIII, X, желатины, энтактин, аггрикан, казеин, а2макроглобулин, ММП2, ММП9, инсулиноподобный фактор роста.