Регуляция функциональных свойств белков за счет сайт-специфичного убиквитилирования

• Автор: Чернорудский, Александр Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 109 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1 Компоненты системы убиквитина

1.1.1 Убиквитин структура и свойства

1.1.2 Строение мультиубиквитиновых цепей и убиквитин

белковых конъюгатов

1.1.3 Убиквитиноподобные белки

1.1.4 Убиквитинсвязывающие домены

1.2 Механизм убиквитилирования и его регуляция

1.2.1 Организация ферментативного каскада

убиквитилирования

1.2.2 Узнавание субстратов убиквитин лигазами

1.2.3 Деубиквитилирующие ферменты
1.2.4 Автоубиквитилирование
1.3 Клеточные функции убиквитилирования
1.3.1 Убиквитин протеасомная система деградации белка
1.3.2 Непротеолитические функции убиквитилирования
1.4 Роль убиквитина в патологии
1.4.1 Нейродегенеративные заболевания
1.4.2 Гипоксия ишемия
1.4.3 Злокачественные образования
1.5 Применение массспектрометрии для исследования
системы убиквитина
2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы
2.2 Методы
2.2.1 Реакция убиквитилирования i vi
2.2.2 Культивирование клеточных линий
2.2.3 Стимуляция эндоцитоза по схеме с
предварительным связыванием лиганда
2.2.4 Иммунопреципитация
2.2.5 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в
присутствии додецилсульфата натрия ДСНПААГ
2.2.6 Иммуноблоттинг
2.2.7 Трипсинолиз и экстракция пептидов
2.2.8 Массспсктрометрия с Iионизацией
2.2.9 Массспсктрометрия ионноциклотронного резонанса
2.2. Биоинформатический анализ убиквитилирования
3. Результаты и их обсуждение
3.1 I viv исследование убиквитилирования рецептора
эпидермального фактора роста
3.1.1 Функции и пути его внутриклеточной
сортировки
3.1.2 Идентификация сайтов убиквитилирования
3.1.3 Влияние подавления тирозинкиназной активности
на его убиквитилирование
3.1.4 Влияние Сконцевого домена молекулы рецептора на
убиквитилирование
3.1.5 Обсуждение
3.2 Изучение механизма авгоубиквитилирования
дрожжевого убиквитинконъюгирующего фермента 3 i vi
3.2.1 3 функции и механизмы
3.2.2 Оптимизация реакции автоубиквитилирования
3.2.3 Идентификация сайтов убиквитилирования с
помощью массспектрометрии
3.2.4 Обсуждение
3.3 I ii исследование влияния убиквитилирования на
функциональную активность белков мишеней
3.3.1 Создание базы данных убиквитилированных белков
i
3.3.2 Убиквитилирование оротидин 5фосфат
декарбоксилазы
3.3.3 Убиквитилирование пероксисомальной цитрат синтазы
3.3.4 Убиквитилирование кальмодулина СаМ
3.3.5 Убиквитилирование Хсвязанного ингибитора апоптоза
3.3.6 Обсуждение
Выводы
Цитированная литература
Список основных сокращений и обозначений
Приложение 1.
Введение


Это связано с тем, что кодируемый убиквитилированием сигнал гетерогенен и определяется как типом модификации присоединение одного остатка убиквитина или мультиубиквитиновых цепей различного строения, так и специфичностью сайтов убиквитилирования. Изучение механизмов и молекулярнофизиологических последствий убиквитилирования невозможно без определения специфических сайтов модификации, так как присоединение убиквитина по разным остаткам лизина различным образом влияет на судьбу белкамишени и может давать старт различным клеточным процессам. Применение массспектрометрии к исследованию системы убиквитина позволяет не только идентифицировать белкимишени убиквитилирования, но и определять сайты модификации и архитектуру мультиубиквитиновых цепей. В свою очередь, прямая идентификация сайтов убиквитилирования открывает возможности для анализа пространственного расположения присоединенного остатка убиквитина но отношению к функционально важным участкам поверхности белкамишени. Это позволяет в ряде случаев спрогнозировать прямые эффекты убиквитилирования, реализующиеся на уровне индивидуального белкамишени и непосредственно затрагивающие его функциональную активность. Цель работы идентифицировать сайты убиквитилирования ряда белков и определить функциональное значение данных сайтов в регуляторном контексте. Убиквитинзависимый механизм репарации ДНК у дрожжей, опосредованный ферментативным комплексом иЬсМтз2. На основании полученных данных и i ii анализа выявить возможный механизм прямого влияния убиквитилирования на функциональные свойства белковмишеней. Убиквитин небольшой термостабильный белок, состоящий из аминокислотных остатков. Он присутствует во всех типах эукариотических клеток и характеризуется крайне консервативной структурой у всех эукариот убиквитин дрожжей vii отличается от убиквитина человека всего по трем аминокислотным остаткам. Молекулярная масса убиквитина составляет 8,5 кДа. Вторичная структура молекулы представлена эластичной аспиралыо и складчатостыо. Ядро сформировано из гидрофобных остатков , iv, . Убиквитин крайне устойчивый белок по отношению к изменениям , температуры и протеолизу. Компактная структура молекулы с избыточными водородными связями вносит вклад в ее стабильность. Стерминальный фрагмент, однако, восприимчив к трипсину, который отщепляет Сконцевой диглицин и инактивирует белок i, iv, . Убиквитин кодируется семейством генов в форме предшественников, представляющих собой объединение нескольких белков i i . В геноме всех эукариот присутствуют два основных типа таких генов полиубиквитиновые гены и слитные гены убиквитина и рибосомальных белков. Такие гены имеют дизайн, позволяющий клетке быстро продуцировать большое количество молекул убиквитина. Гибридные гены, в которых моноубиквитин слит с рибосомальными белками, также были найдены в геноме многих организмов . Предполагается, что убиквитин в случае такого гибридного белка служит своего рода шапероном, способствующим правильному формированию рибосом i . Интересно, что хотя нуклеотидная последовательность убиквигиновой ДНК среди разных организмов не является консервативной, аминокислотные последовательности генного продукта различаются крайне незначительно, что говорит о консервативности выполняемой им функции . Одним из основных свойств убиквитина является его способность полимеризоваться в мультиубиквитиновую цепь. При этом две молекулы убиквитина ковалентно соединяются изопептид ной связью, возникающей между Стерминальным глицином одной молекулы и еаминогругшой лизина другой. Показано, что каждый из 7 остатков в молекуле убиквитина лизины 6, , , , , , способен участвовать в формировании изопептидной связи со следующей молекулой убиквитина . Вариации связывания остатков убиквитина определяют множественность внутриклеточных последствий убиквитилирования. В частности, мультиубиквитиновая цепь, состоящая из четырех или более мономеров, объединенных изопептидной связью через , может служить сигналом к деградации белка в системе АТФзависимого протеолитического комплекса протеасомы i, .