Изучение белок-белковых взаимодействий в Д-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназе

• Автор: Ашмарина, Л.И.
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экспериментальные подходы, используемые для получения и изучения свойств изолированных субъединиц олигомерных ферментов
1.2. Структура ГАФД и прявления взаимодействия субъединиц в олигомерной молекуле фермента .

1.3. Факторы, влияющие на функционирование ГАФД в физиологических условиях .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы

2.2. Получение 1,3дифосфоглицерата.

2.3. Выделение ГАФД из пекарских дрожжей

2.4. Выделение фосфоглицераткиназы из пекарских дрожжей .

2.5. Иммобилизация ферментов

2.6. Определение концентрации белка
2.6.1. Определение концентрации растворимого белка
2.6.2. Определение концентрации иммобилизованного белка
2. ,7. Определение активностей ферментов . .
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение нативных мономеров ГАФД
3.2. Получение иммобилизованных мономеров ЛДГ. .
3.3. Получение иммобилизованных тримеров ГАФД. .
3.4. Проявление межсубъедини чной кооперативности ГАФД в катализе .
3.5. Комплекс ГАФД с фосфоглицераткиназой
3.6. Влияние образования комплекса ГАФД с фосфоглицераткиназой на кооперативность активных центров ГАФД .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


А в другой работе ГУ анализ механизма диссоциации, денатурации и гибридизации лактатдегидрогеназы в этиленгликоле позволил допустить способность мономерной формы к цроявлению каталитической активности. Анализ кинетики реактивации митохондриальной малатдегидрогеназы, диссоциирующей при изменении раствора на неактивные мономеры С,1, У привел также к неоднозначным результатам. Енике и соавт. Но в то не время Вуд и соавт. 5,0 к 7,5 зависит от конформационного изменения, затрагивающего микроокружение одного из цистеиновых остатков. Изучение диссоциации димерной молекулы креатинкиназы в денатурирующих условиях показало, что реактивация подчиняется кинетике первого порядка по отношению к концентрации белка С 7, то есть основную роль играют конформационные изменения молекулы фермента, а не восстановление четвертичной структуры. Однако исследование цродуктов реактивации, проведенное цри использовании поперечносшнвающего агента, показало, что уже на самых первых ее стадиях образуются димеры. Возвращение нативной конформации мономеров, вероятно, сопровождается их быстрой реассоциацней. Таким образом,интерпретация результатов экспериментов, проводимых с различными формами олигомерного фермента в растворе, затруднена. Поэтому плодотворным может быть использование методических подходов, позволяющее исследовать свойства изолированных субъединиц в условиях, исключающих их ассоциацию в олигомер. В растворе этого можно достигнуть либо модификацией аминокислотных остатков на поверхности субъединиц, препятствующей их агрегации 6,,9 У, либо фиксированием фермента в определенном олигомерном состоянии с помощью поперечносшивающих реагентов , 7,. Но использование модификации аминогрупп в ряде случаев не является оптимальным способом получения субъединиц. Так, цри увеличении числа оукцинилированных аминогрупп у дрожкевой гексокиназы не только возрастает количество образующихся мономеров, но и снижается каталитическая активность фермента С 9 7. Это снижение может быть связано не собственно с диссоциацией на субъединицы, а с модификацией важных для катализа групп или с нарушением нативной конформации белка. Видимо, любое использование для таких экспериментов химических реагентов, обладающих высокой реакционноспособностью, не позволяет однозначно решить вопрос о причинах изменения каталитических или регуляторных свойств изолированных субъединиц. Может быть, одним из оптимальных способов получения субъединиц в растворе будет использование, так называемых обращенных мицелл С ,3 У. Обращенные мицеллы образуются при смешивании органического растворителя, поверхностноактивного вещества и небольшого количества воды. Варьируя соотношение этих компонентов, можно получить мицеллы со строго определенными размерами их внутренней полости У У. Но необходимо учитывать, что свойства субъединиц могут измениться за счет их микроокружения внутри мицеллы. Также вероятен переход субъединиц из одной мицеллы в другую. Одним словом, этот метод нуждается в дополнительной разработке. В настоящее время одним из наиболее перспективных и плодотворных подходов является иммобилизация ферментов на нерастворимых носителях. Наиболее приемлемыми для изучения структуры и функции белков являются носители на основе агарозы, которые обладают высокой гидрофильностью, емкостью и минимальной неспецифической сорбцией Си. Они достаточно црочны, в них могут быть введены различные функциональные остатки, удобные для ковалентного и нековалентного связывания белка. Одним из наиболее широко распространенных методов иммобилизации белков является бромциановый, при котором во взаимодействие с носителем вовлекаются Уеягруппы. Реакция осуществляется по следующей схеме С II7 см. Во взаимодействие с носителем вступает только непротонированная форма аминогруппы. При 9,5,0 реагируют в основном оС аминогруппы и аминогруппа лизина, а при 8,09,0 лучше всего сопрягаются ароматические амины С7. Варьируя , можно подобрать условия, когда во взаимодействие с носителем вовлекается ограниченное количество Унггрупп, не существенных для активности фермента. Очень важным моментом при всех способах иммобилизации является стабильность образующейся ковалентной связи.