Участие ферментов фенолоксидазного комплекса в защитных реакциях насекомых

• Автор: Сухорукова, Ольга Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 139 с. : ил

з

2.4. Определение уровня экспрессии гена профенолоксндазы.

2.4.1. Молекулярная гибридизация

2.4.2. Клонирование фрагмента ДНК, использованного в качестве гибридизационного зонда.
2.4.3. Секвеннрование фрагмента ДНК, использованного в качестве гибридизационного зонда

2.4.4. Радиоактивное мечение гибридизационного зонда

2.4.5. Состав использованных стандартных растворов и сред.

2.5. Математическая обработка результатов

Г лава 3. Активность ферментов фсиолоксидазного комплекса в норме

3.1. Органная локализация тирозиназной и ДОФАоксндазной активностей

у медоносных пчел среднерусской и кавказской рас

3.2. Динамика тирозиназной и ДОФАоксндазной активностей в онтогенезе комнатной мухи
3.3. Аскорбиновая кислота в метаболической регуляции двух типов фенолоксидазной активности.
Глава 4. Изменения активности ферментов фенолоксидазного комплекса при
температурном стрессе.
4.1. Динамика ДОФАоксндазной активности у медоносных пчел при кратковременном температурном стрессе
4.2. Динамика тирозиназной и ДОФАоксндазной активностей у медоносных пчел среднерусской и кавказской рас при тепловом стрессе и ее изменение под дейсгвием аскорбиновой кислоты
4.3. Различия изменений тирозиназной и ДОФАоксндазной активностей у двух фенотипических групп колорадского жука при
тепловом стрессе
Глава 5. Изменение фснолоксидазиой активности при инфекционном процессе
5.1. Динамика ДОФАоксндазной активности и экспрессии ена профенолоксндазы у пчел среднерусской и кавказской рас при воздействии БТБ.
5.2. Динамика активности тирозин азы у пчел среднерусской к кавказской рас при воздействии БТБ.
5.3. Связь эффекта иммунизации у разных групп медоносной пчелы с уровнем фенолоксидазной активности
5.4. Связь эффекта иммунизации с уровнем фенолоксидазной активности у колорадского жука.
Заключение.
Выводы.
Л тература
Список сокращений
ДОФЛ диоксифенилапанин
БТБ бнтоксибациллнн
ПЦР полимеразная цепная реакция
дНТФ дсзоксирибонуклсозидтрифосфат
ддНТФ дидсзоксирибонуклеозидтрифосфат
ДСП доле пил сульфат натрия
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
Введение


Участие фенолоксидаз в защитных реакциях насекомых. Фснолоксидазы широко распространены в живой природе. Насекомым здесь отводится особое место, поскольку спектр физиологических функций фенолоксидаз у них весьма широк. Изучение фенолоксидаз насекомых началось с установления их причастности к процессам меланизации и склсротизации кутикулы и в дальнейшем велось достаточно интенсивно. Однако анализ имеющихся литературных данных сегодня в значительной степени затруднен. Затруднения вызваны тем, что изучение фенолоксидаз на протяжении долгого времени велось без уделения должного внимания их специфичности. В году К. Т. УаипоЬи, предположив, что ни одна из предложенных теорий реакционной способности потенциальною субстрата не может объяснить имеющиеся факты, ввел термин полифенолокендаза. Термин не позволял различать фснолоксидазы с разным типом активности, однако он по ссй день широко используется биохимиками растений Ппруаропд е а. Маяавипс е а. В году комиссия по биохимической номенклатуре объединила фснолоксидазы под общим названием монофснолмонооксигсназа, КФ 1. Диксон, Уэбб. К этому времени в исследованиях на насекомых уже было показано участие нескольких различных типов фенолоксидаз в склеротнзации и меланизации кутикулы Гилмур, . Сегодняшняя номенклатура фенолоксидаз включает три самостоятельных фсрмсгга, каждый из которых был описан у насекомых. Монофснолмоноокснгсназа, КФ 1. Для згой цели необходим дополнительный донор электронов косубстрат. В качестве донора электронов может выступать сам дифенольвый продукт реакции гндрокенлирования. Двойственный характер активности фермента позволяет отнести его к числу оксидаз со смешанными функциями Марри и др. Катехолоксидаза. КФ . Слабо действует на дифенолы с боковой карбоксильной группой. Лакказа, КФ . Н Хорошими субстратами для лакказы также являются аминофенолы, пфенилендиамин, полифенолы, ряд неорганических ионов и даже, что ранее отрицалось, одифенолы vi . Низкая субстратная специфичносгь резко отличает лакказу от двух других фенолокендаз. По этой причине, тирознназа и дифенолоксидаза в литературе еще часто называются фенол азами, но это не распространяется на лакказу Харборн, . В организме насекомых фенолазы занимают важное место в обмене тирозина и его производных. Они вызывают окисление тирозина в 3,4диоксифснилаланин тирозиназа и 3. Наиболее полно по сравнению с другими насекомыми изучен фенолазный комплекс у i . На электрофоретических спектрах тирозиназа и дифенолоксидаза у нес представлены гремя фракциями. Тирознназе соответствует быстро мшрирующая фракция А1, а дифенолоксидазс две близко мигрирующие фракции А2 и 3 i, , . Было установлено, что данные молекулярные формы ферментов кодируются отдельными структурными генами Мох. Позднее для i , , и i viii Раушенбах и др. Следует ожидать. Шесть различных клонов кДНК СНОВ профенолоксидазы были выделены у i и картированы три различных хромосомальных локуса i а. В геноме i, по результатам геномной Саузсрн блотгибридизации, также предполагается присутствие более чем одного гена профенолоксидазы i . Детальное изучение физикохимических свойств и структуры фенолоксидаз насекомых призвано расширить понимание их функций и механизмов регуляции. Оптимум фенолаз для разных видов насекомых был установлен в диапазоне . Специфическим ингибитором для них является фенилтиомочевина, но, возможно, что крезолазная и катсхолоксидазная активности подавляются ею в разной степени ii . Для фенолаз показана способность к агрегации, в связи с чем не рекомендована их активация до проведения электрофореза i, , Раушенбах и др. В нативном состоянии известные фенолазы насекомых являются том о и гстсродимсрамн i о . В тех случаях, когда был выделен неактивный профермент, мономер имел молекулярную массу кДа. После протеолитической активации, которая у членистоногих в отличие от грибов и растений происходит в концевой части полипептида, масса активного фермента равнялась кДа . Кроме того, было показало, что фенолазы в составе белковых комплексов могут иметь молекулярную массу около 0 кДа.