Получение рекомбинантного человеческого эндостатина и исследование его антиангиогенных и противоопухолевых свойств

• Автор: Позднякова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

Список сокращений
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Опухолевый ангиогенез и инвазия: общие механизмы
регуляции
1.2. Краткая история развития представлений об ангиогенезе
1.3. Эндостатин: физико-химические свойства, происхождение
1.3.1. Коллаген XVIII
1.3.2. Изоформы коллагена XVIII
1.3.3. Структурная организация молекулы эндостатина
1.3.4. Образование ß-структур
1.4. Механизм действия и физиологические функции
эндостатина
1.4.1. Протеолитические пути получения эндостатина
1.4.2. Рецепторы эндостатина
1.4.3. Свойства пептидных фрагментов эндостатина
1.5. Перспективы клинического применения эндостатина
1.5.1. Общие подходы к антиангиогенной терапии
1.5.2. Перспективы терапевтического использования
рекомбинантного человеческого эндостатина
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы
2.2. Клеточные линии
2.3. Конструирование экспрессионного вектора эндостатина
человека
2.4. Наращивание биомассы штамма-продуцента Е, coli
2.5. Получение растворимого рекомбинантного эндостатина из

штамма-продуцента E. coli
2.6. Получение липосомной формы эндостатина
2.7. Получение наночастиц и определение их размеров
2.8. Методика культивирования клеток для проведения
исследований на покоящемся и пролиферирующем эндотелии
2.9. Определение ЦТА эндостатина в отношении культур клеток
MCF-7, DU 145, АВАЕ, SVEC4-10, bSMC и фибробластов человека
2.10. Определение ЦТА эндостатина в отношении клеток линии
HUVEC
2.11. Оценка выживаемости клеток
2.12. Исследование противоопухолевой активности препаратов
рекомбинантного эндостатина in vivo
2.13. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Конструирование экспрессионного вектора и биосинтез
рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента Escherichia coli JM
3.2. Получение растворимого рекомбинантного эндостатина из
E. coli
3.2.1. Получение телец включения
3.2.2. Солюбилизация телец включения
3.2.3. Ренатурация эндостатина
3.2.4. Гель-фильтрация
3.3. Цитотоксическая активность рекомбинантного эндостатина в
отношении эндотелиальных клеток линий HUVEC, АВАЕ и SVEC4
3.4. Цитотоксическая активность рекомбинантного эндостатина в отношении гладкомышечных, соединительнотканных и

раковых клеточных линий
3.5. Получение наночастиц, содержащих рекомбинантный эндостатин, и исследование их терапевтического противоопухолевого потенциала в модельных экспериментах
in vivo
3.6. Получение липосомиой формы рекомбинантного эндостатина
и исследование ее антиангиогенной противоопухолевой активности in vivo
3.7. Исследование возможности применения липосомной формы
рекомбинантного эндостатина в схемах противоопухолевой комбинированной терапии
Выводы
Список цитированной литературы

Фрагмент гена коллагена XVIII был обработан рестриктазами BamHI и Hindlll и клонирован между BamHI- и HindIII-сайтами вектора pQE. Полученный вектор назвали pQE-End.
2.4. Наращивание биомассы штамма-продуцента E
Для экспрессии рекомбинантного эндостатина были использованы клетки E. coli штамма JM 109. Штамм-продуцент трансфицировали плазмидой pQE-End и наращивали в Юл ферментёре с лопастной мешалкой и принудительной аэрацией. Скорость вращения мешалки 400 об/мин, расход воздуха на аэрацию 10 л/мин. Для наращивания использовали среду LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л натрия хлорида, pH 7.5) с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и глюкозы (0.2 %). Клетки выращивали в течение 12 ч при 37°С в среде LB. Затем культуральную среду разбавляли в 25 раз свежей средой LB с ампициллином и наращивали 2-3 ч до плотности СЮбоо= 0,4-0,6, после чего вносили изопропилтиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0,2 мМ для индукции синтеза эндостатина. Осуществляли наращивание бактериальной биомассы в течение 3 ч, после чего отделяли биомассу от культуральной среды центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин. Продукцию белка ожидаемого размера контролировали с помощью электрофореза в 15% ПААГ в присутствии ДСН.
2.5. Получение растворимого рекомбинантного эндостатина из
штамма-продуцента E
Получение телеи включения
Осадок клеток продуцента получали центрифугированием культуральной жидкости в течение 10 мин при 2500 g и 4°С с последующим ресуспендированием в буфере А, содержащем 0,1 М раствор трис-гидрохлорида, pH 8.0. Затем к суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 50 мкг/мл. Раствор инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Суспензию подвергали обработке ультразвуком в течение 2 мин